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工业微生物产生菌的分离筛选【3】
在分离以氯化物为氮源的细菌时,把浸透了KCN溶液的滤纸放到平皿盖上,滤纸所产生的HCN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基,每天用新制备的浸湿KCN的滤纸更换,培养一段时间后,从平皿上长出的菌落中进行分离,便容易得到分解氰化物的菌株。

 

由于塑料工业的发展,环境中到处都有各种高分子包装废弃物,这些污染物多为不溶于水的高分子化合物,获得其降解菌株较为困难。通常采用富集法进行筛选,如日本的小野胜道教授以低浓度聚乙烯作为富集培养基对土壤微生物进行驯化,分离到了三种能降解聚乙烯的细菌。在淀粉塑料的降解试验中,采用加富土壤淹埋法,筛选到的降解微生物主要是霉菌与放线菌。这可能是因为丝状体更容易深入共混物内部生长。尤其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均匀,由于聚乙烯的流动性好,因而在吹塑过程中膜表面的聚乙烯含量偏高,使细菌在初期很难降解这类共混物,所以在降解菌的研究方面应着重考虑霉菌与放线菌。除驯化培养进行降解菌的筛选外,还可采用阶段式筛选法。如在分离聚乙二醇降解菌时,可先筛选能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇的微生物,再从中筛选能降解聚乙二醇的菌株,也能达到较好的效果。

除寻找能够降解废旧塑料的微生物外,根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代现有塑料。目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纤维素类生物降解塑料等。有些生物降解塑料是以简单的物理共混工艺,将淀粉填充到聚乙烯等树脂内,淀粉可以被微生物分解,但树脂分子骨架在很长时间内仍分解不了,反而为废弃塑料的回收增加了困难。而一些聚脂类高分子由于具有和微生物本身可合成的聚β-羟基丁酯(PHB)相类似的结构,无毒,且能在酸、碱和微生物条件下完全降解,同时具有良好的塑性,用途宽广的多。用微生物发酵法生产的聚β-羟基脂肪酸(polyhydroxyalkanoic acid,PHAs)也成为研究生物降解塑料的热点,其中利用真氧产碱杆菌(Alcaligtnes eutrophus)合成PHB的研究最多。另外,还有固氮菌(Azotobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、生丝微菌(Hyphomicrobium X)、菌宿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、嗜盐杆菌(Halobacteria)等。目前人们已经克隆到PHAs合成途径的关键酶基因,包括:phbA(β酮硫裂解酶基因)、phbB(依赖NADPH的乙酰CoA还原基因)、phbC(PHB合成酶基因)。许多实验室已在进行酶基因导入E.coli的工作,期望利用E.coli大批量合成PHB。总之,利用廉价碳源的高产菌株的发现与选育是降解塑料领域中最有意义的研究之一。

二、通过控制培养和培养条件进行分离

各种微生物对营养要求和培养条件是不同的,在分离筛选时若在这两个方面加以调节控制,就能获得更好的分离效果。

1.培养基的营养成分

各种微生物对碳源、氮源要求各异,有的对营养还有特殊的要求,事先了解被分离微生物的营养要求,从而设计一个合理快速的分离培养基,能够收到事半功倍的效果。

放线菌是生产抗生素酶制剂的重要来源。在选择分离放线菌时,通常采用改良的HV琼脂培养基、土豆-胡萝卜水汁液培养基和淀粉琼脂培养基能取得较好的效果。但不同菌种对营养要求差别很大,如奴卡氏菌在有氧条件下用普通培养基即可分离到,而以色列放线菌则在有CO2存在且有适宜培养基的情况下才能正常生长繁殖。

筛选水解酶产生菌时,通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分离,如以淀粉为碳源的培养基可鉴定菌落能否产生淀粉酶;一种含纤维素粉为碳源的分离培养基,可以鉴别纤维素酶产生菌;用含有酪蛋白为有机氮源的平板培养基,可以鉴别蛋白酶的产生菌。纯种分离时,把以上琼脂平板置于适宜的温度培养一定的时间,如具有产生水解酶能力的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,根据圈的大小可初步判断酶活力强弱。测定水解圈直径与菌落直径之比,把比例大的菌落移入斜面保藏,供进一步筛选。

2.培养基的pH

细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱,霉菌和酵母菌要求偏酸。因此,分离培养基的pH应该调节到被分离微生物要求范围。这不仅有利于自身生长,也可排除一部分不需要的菌类。例如,分离柠檬酸产生菌的黑曲霉,就是利用调节培养基的酸碱度获得成功的。其分离方法是:取红芋粉醪20%、柠檬酸10%~20%配成培养液,调节pH2.0~2.5,以一定量的培养基和土样均匀混合,用毛细吸管点种在平皿内事先覆盖的无菌滤纸上(2~3层),于30℃培养,这样可以分离到产生柠檬酸的黑曲霉。

分离碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时,可以把培养基调到pH9~11,在此范围内不宜生长的微生物被抑制,这对分离本身起到浓缩作用。大多数水解酶的生长最适pH基本相近,而酶的作用pH未必与产酶pH相同。

培养基的pH要结合营养成分和培养条件来考虑。因为微生物在生长繁殖过程中,由于代谢作用会产生酸性或碱性产物,pH发生变化,微生物生长受到抑制。一般培养基中碳氮比(C/N)高者,培养后倾向于酸性,反之则倾向于碱性。无机盐的性质也会影响pH变化,(NH4)2SO4是生理酸性无机氮源,其中NH4+被菌体利用,留下SO42—,培养液变成酸性。而NaNO3是生理碱性氮源,其中NO3—被菌体分解利用后,剩余Na+,使培养液变成碱性。如发酵过程缺氧,则代谢向有机酸合成方向进行,pH下降。为了维持培养基的ph,一般要加磷酸盐,如K2HPO4、KH2PO4,使培养基具有一定的缓冲能力。如果培养液中的酸碱变化很大,磷酸盐的缓冲容量不足以调节pH变化,则可适当加入碳酸钙,以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类,使培养基的pH能保持在恒定的范围内。此外,在分离霉菌时,加几滴乳酸不仅可以维持一定酸碱度,而且可以抑制细菌的生长。

3.排除不需要的菌类

采取调节pH的方法来抑制非目的微生物的生长,虽然能起到一定的作用,但并不是对所有的菌类都有效。有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长,而个别的霉菌,也同样可以在中性或偏碱的培养基中生长。为了更有效地抑制非目的微生物的生长,要加入一些专一性的抑制剂。

(1)分离细菌时,在培养基中加入浓度为50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生长。

(2)分离放线菌时,在样品中加入0.05%十二烷基磺酸钠(SDS)不仅可以抑制细菌的生长,还能激活放线菌孢子的萌发。加入氟哌酸(5mg/L)+制霉菌素(50mg/L)+青霉素(0.8mg/L)也可以有效地抑制细菌和真菌,而不影响放线菌的生长。

(3)分离霉菌和酵母菌时,在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml,可以抑制细菌和放线菌生长。

(4)分离根霉和毛霉时,由于这些微生物的菌丝易蔓延成片,难以得到纯化的菌落,通常在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延,使菌落长得小而紧密。

一般用于分离单一目的微生物的培养基中均含有抑制其他微生物的抑制剂,这些专用的抑制剂在小型实验室配制较麻烦,现已有成品供应,只要直接加入基础培养基即可。如氨苄西林,主要用于分离亲水气单孢菌。

4.控制培养温度

控制培养温度,也是一种获得目的微生物的有效措施。各类微生物生长温度不同,从大范围来看,可分三大类:一类是高温微生物,最适温度在50~60℃。如果要分离这类菌可将分离培养基置于50~60℃温度下培养,能抑制一些嗜冷、中性微生物生长,可以有效地分离到高温菌类。第二类是中温微生物,它们的最适生长温度是20~40℃,超过50℃,就停止生长。这类微生物最为常见,、数量都占首位。工业发酵微生物绝大多数都属于此类。其中不同类群微生物对温度又有所差别,一般细菌、放线菌最适温度为25~37℃,霉菌和酵母最适温度为20~28℃。第三类为低温微生物,它们的最适温度为15℃或更低。当从样品中分离各种菌类时,分别置于自身最适温度下培养也可大体上抑制另一些微生物的生长。当分离某些特殊产物的微生物时,对温度的选择还需考虑某些内在的关系,如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时,由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高,其凝固点越低,即细胞在较低温度下仍能表现出活力,因此在低于正常温度10℃下分离效果最好。

三、厌气菌的分离

好气菌要在有氧条件下培养,嫌气菌要在厌氧状况下才能生长。工业发酵所用菌种为厌气菌的有丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌,白酒增香用的丁酸菌、己酸菌及用于环境污水处理和水产养殖用的光合菌、反硝化菌、脱氮排硫杆菌等。它们生长于水底层及沉积物中,要从样品中分离这类菌,需采取厌气培养法,否则菌体因接触氧气而死亡。因此,培养过程中要除去氧气,现介绍如下几种方法:

(一)加还原剂

分离培养基内加入还原剂,如半胱氨酸、D型维生素C、硫化钠等,操作时以最快的速度划线分离,然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内(充CO2或N2也可),于室温培养。

(二)焦性没食子酸法

焦性没食子酸和NaOH互相反应除去氧气。操作时,先将焦性没食子酸放在容器中,把含有厌氧菌样品的培养皿架空放入容器内,然后加入NaOH溶液,立即盖上盖子,并用石蜡或凡士林密封,放到室温下培养。要除去100ml空气中的氧气需要焦性没食子酸固体1g和10%NaOH溶液10ml。

(三)平皿厌气培养法

取无菌培养皿一套,在皿盖内  到上分离培养基,凝固后,皿底一侧放焦性没食子酸固体,另一侧放10%NaOH溶液,使二者不相接触。准备完毕,在凝固的琼脂平板上迅速把含厌氧菌样品进行划线,然后盖上皿盖并密封,摇动平皿使焦性没食子酸固体和NaOH溶液混合,发生化学反应,除去皿内的氧气,置适宜温度下进行培养。
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