LncRNA OIP5-AS1··
·HuR
cyrano（LncRNA OIP的反义RNA1）
对RNA结合蛋白HuR
起到海绵吸收的作用
文章简介
文 章 标 题 | LncRNA OIP5-AS1cyrano sponges RNAbinding protein HuR |
中 文 题 目 | cyrano（LncRNA OIP的反义RNA1）对RNA结合蛋白HuR起到海绵吸收的作用 |
期 刊 名 | Nucleic Acids Research IF=9.202 |
作者 | Jiyoung Kim, Kotb Abdelmohsen, Xiaoling Yang, Supriyo De, Ioannis Grammatikakis, Ji Heon Noh and Myriam Gorospe |
发 表 时 间 | 2016 |
实 验 材 料 | HeLa |
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研究背景
绝大多数哺乳动物长非编码（lnc）RNA的功能仍然未知。在这里，我们对高度丰富的哺乳动物lncRNA OIP5 AS1，在斑马鱼中称为cyrano的lncRNA分析表明，OIP5 AS1抑制细胞增殖。在人宫颈癌HeLa细胞中，RNA结合蛋白HuR，其增强细胞增殖，与OIP5-AS1相关并稳定它。将OIP5-AS1与MS2发夹结合以鉴定相关微RNA揭示了miR-424与OIP5-AS1相互作用并与HuR竞争结合OIP5-AS1。我们进一步确定了OIP5-AS1的“海绵”功能，因为高水平的OIP5-AS1增加了HuR-OIP5-AS1复合物并阻止了与靶mRNA（包括编码增殖蛋白的那些）的HuR相互作用，而相反地，降低OIP5-AS1增加与靶mRNA的HuR复合物的丰度。我们建议OIP5 AS1作为海绵或竞争内源（ce）RNA的HuR，限制其可用性到HuR目标mRNAs，从而抑制HuR引起的增殖表型。
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研究结果
1. lncRNA OIP5-AS1 / cyrano减少人宫颈癌细胞的增殖
为了开始检测lncRNA OIP5-AS1的功能，我们通过转染针对OIP5-AS1的siRNA池沉默HeLa细胞中的功能，并研究随后的细胞数量的变化。 如图1A所示，沉默OIP5-AS1促进细胞增殖，如通过计数细胞数目评价长达5天; 在检查的时间，通过RT确定的OIP5-AS1水平有效地降低，随后通过qPCR分析（图1B）。 单个siRNA具有类似的效果。 [3H] - 胸苷掺入复制DNA的分析确定沉默OIP5-AS1增加细胞增殖（图1C），并且FACS显示沉默OIP5-AS1增加S和G2 / M细胞区室的相对大小（图1D） 。 总之，这些结果表明降低OIP5-AS1通过细胞分裂周期增强进展，并表明OIP5-AS1抑制细胞增殖。
2. RNA结合蛋白HuR结合并稳定OIP5-AS1
在注释人类序列（9837 lncRNAs，Ensembl v72）（35,36）的广泛的lncRNA集合中，OIP5-AS1被鉴定为cyrano的人同源物，即在斑马鱼发育中起作用的lncRNA 基因结构中的显着保守性。 OIP5-AS1（15.6-kb长）在最长的内含子之后包含三个短外显子和长的第四外显子; 成熟转录物（1.9kb长）显示在图2A中。 搜索OIP5-AS1相互作用伙伴揭示了在四个不同位点（24，GSM738185）与OIP5-AS1相关的RBP HuR（图2A，绿色）。
我们通过使用抗HuR和对照IgG抗体的核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）分析验证了HuR和OIP5-AS1之间的相互作用;在从IP样品中提取RNA后，使用RT-qPCR分析来测量OIP5-AS1水平，并在每个IP样品中归一化为GAPDH mRNA水平。发现OIP5-AS1在HuR IP样品中相对于IgG IP样品（图2B）是高度富集的（> 15倍），显示HuR选择性地与OIP5-AS1缔合。为了研究HuR结合OIP5-AS1的生物学意义，我们首先检查HuR是否调节OIP5-AS1的稳定性。在HeLa细胞中沉默HuR后48小时，从总RNA的RT-qPCR分析揭示OIP5-AS1稳态水平降低3倍（图2C）。为了研究这种减少是否是由于增加的OIP5-AS1衰变，将HeLa细胞在放线菌素D存在下孵育以阻断从头转录，并且测量OIP5-AS1的半衰期为达到50％的在0小时时（在加入放线菌素D之前）存在的RNA水平;非常稳定的lncRNA，7SL，并行评估。与对照细胞相比，其中OIP5-AS1 RNA是相当稳定的，沉默HuR将OIP5-AS1半衰期降低至9.5小时（图2D），表明HuR有助于稳定OIP5-AS1。
3. 鉴定当HuR沉默时具有增强的与OIP5-AS1结合的miRNA
为了探讨HuR稳定OIP5-AS1的机制，我们研究了是否其它因素可能牵涉调节OIP5-AS1半衰期。 使用“RegRNA 2.0”和“IntaRNA”的模拟分析鉴定了可能与OIP5-AS1相互作用的30个miRNA。 RIP分析Argonaute 2（AGO2），miRNA相关RISC的一个重要组成部分，表明OIP5-AS1富集在AGO2复合物，作为进一步证据OIP5-AS1与miRNA相关联。
为了研究OIP5-AS1是否直接与细胞中的这些miRNA结合，我们制备了表达用MS2发夹标记的OIP5-AS1的载体，并且与融合蛋白共表达HeLa细胞中的嵌合RNA（OIP5-AS1-MS2）其含有融合至识别MS2发夹结构域（MS2-GST）的谷胱甘肽-S-转移酶结构域。在OIP5-AS1-MS2与MS2-GST形成复合物后，通过使用谷胱甘肽（GSH）包被的珠子将与嵌合RNA相关的miRNA降低（图3A）。从珠提取RNA后，我们使用RT-qPCR分析筛选预测具有与OIP5-AS1相互作用位点的miRNA，并进一步测试如果沉默HuR（如图2C）改变相互作用的程度。其中，当HuR被沉默时，9个miRNA显示出与OIP5-AS1-MS2的增强的结合。 miR-424和miR-671优先在OIP5-AS1-MS2下拉材料中比对照转染细胞和单独的MS2下拉富集，尽管miR-671在MS2下拉中比miR-424（图3B ， 剩下）。 miR-7，包括已知结合OIP5-AS1的miRNA作为阳性对照，并发现在下拉实验中结合OIP5-AS1-MS2（数据未显示）。总之，这些结论表明，沉默HuR增强了某些miRNA对OIP5-AS1的访问，促使我们假设miR-424和HuR可能竞争结合OIP5-AS1。
4. miR-424与HuR竞争结合OIP5-AS1
OIP5-AS1上的miR-424位点不位于紧邻任何HuR位点（图4A）。然而，即使最近的HuR位点> 200个核苷酸以外，OIP5-AS1的折叠可以在miR-424位点附近带来一个或几个HuR位点，使得RNA的二级结构可以导致远端之间的功能性相互作用网站。为了检查miR-424和HuR是否竞争结合lncRNA OIP5-AS1，我们诱变了OIP5-AS1上的核苷酸位置27-34上的miR-424结合位点（图4A）。如上所述（图3A）对表达野生型（wt）OIP5-AS1-MS2和突变的OIP5-AS1（mut）-MS2的HeLa细胞进行MS2下拉; miR-424在wt OIP5-AS1下拉中显示出强的富集，但显示出对OIP5-AS1（mut）的更少的结合（图4B）。 miR-424（Pre-miR-424）的过表达不改变OIP5-AS1水平（图4C），也没有显着改变OIP5-AS1转录速率，OIP5-AS1与AGO2或OIP5-AS1的相互作用的稳定性。
相反，通过蛋白质印迹分析下拉样品显示HuR在OIP5-AS1（mut）下拉样品中更丰富（图4D），表明通过OIP5-AS1上的结合位点的突变降低的miR-424结合允许增强的HuR 结合到OIP5-AS1。 为了进一步测试这个想法，我们通过用Pre-miR-424转染HeLa细胞过表达miR-424，并通过RIP分析测量HuR与OIP5-AS1的结合。 如图所示，当miR-424过表达时，HuR结合对照细胞中OIP5-AS1的10倍富集显着下降到6倍富集（图4E）。 总之，干扰miR-424进入OIP5-AS1的突变允许增强HuR与OIP5-AS1的结合，相反，当miR-424过表达时，HuR与OIP5-AS1的结合显着降低。 这些结果使我们得出结论，miR-424和HuR彼此竞争结合OIP5-AS1。
5. HuR和miR-424与OIP5-AS1的竞争性结合影响HuR与靶mRNA的结合，影响靶mRNA命运
接下来，我们检查了HuR和miR-424竞争结合OIP5-AS1的结果。鉴于HuR与许多mRNA结合并且OIP5-AS1在HeLa细胞中高度表达，我们假设OIP5-AS1和HuR之间的相互作用可能影响HuR结合其他靶mRNA的能力。为了测试这种可能性，我们沉默HeLa细胞中的OIP5-AS1，并且执行与靶CCNA2和CCND1 mRNA（分别编码细胞周期蛋白A2和D1），SIRT1 mRNA（编码sirtuin 1），VHL和TP53mRNA（编码肿瘤抑制基因VHL和p53）和WEE1 mRNA（编码细胞周期激酶WEE1）。如图5所示，相对于在相应对照（Ctrl siRNA）转染中观察到的那些，沉默OIP5-AS1和过表达miR-424各自增强了HuR与靶mRNA的相互作用。 HuRmRNA复合物中增加的富集表明降低OIP5-AS1或增加竞争物miR-424的丰度释放了HuR以结合靶mRNA。
为了研究由于miR-424过表达或OIP5-AS1沉默增加的HuR与靶mRNA的结合影响内源靶mRNA和蛋白质的水平，我们选择CCNA2，CCND1和SIRT1用于进一步分析。在沉默OIP5-AS1后和miR-424过表达后的RT-qPCR和Western印迹分析（图6A-C）显示，CCNA2 mRNA和SIRT1 mRNA的水平显着增加，伴随着CCNA2和SIRT1蛋白水平的升高，而CCND1 mRNA水平没有显着变化，但CCND1蛋白水平适度升高。相反，OIP5-AS1作为融合转录物（OIP5-AS1-MS2）的过表达降低了CCNA2和SIRT1 mRNA水平和蛋白质丰度，并且降低了CCND1蛋白丰度，但不影响CCND1 mRNA水平（图6D-F）。考虑到HeLa细胞在细胞质中具有约1300个拷贝的HuR（细胞中总共17 200个）和约70个细胞质拷贝的OIP5-AS1（在细胞中总共约75个，并且每个单独的OIP5-AS1转录物具有针对HuR的4-6个结合位点，OIP5-AS1可以海绵化30％的细胞质HuR，如果进一步考虑每个位点可以容纳HuR的多个拷贝，因为HuR可以多聚化，并且一些HuR不能结合RNA（例如，在某些残基磷酸化的HuR），则OIP5-AS1可以良好地隔离细胞质HuR的整个库，在这方面，的HuR-OIP5-AS1复合物在HeLa细胞质中的表达远远大于细胞核中的，总之，这些数据支持OIP5-AS1可以控制HuR结合和调节转录后因此，我们建议OIP5-AS1用作HuR的海绵。
6.OIP5-AS1 HuR位点与HuR可用性的调节相关用于结合mRNA
为了巩固OIP5-AS1可以将HuR远离mRNAs的观点的证据，我们试图从OIP5-AS1中删除HuR结合序列。利用从PAR-CLIP分析获得的HuR结合序列的知识（图2A），我们设计了其中HuR位点在3和5末端缺失的构建体（pOIP5-AS1-MS2-53 [p5 3]）图7A，左）。与全长（FL）OIP5-AS1（pOIP5-AS1-MS2-FL [pFL]）相比，该构建体用于评价OIP5-AS1作为HuR的海绵的功能。首先，我们检查了HuR结合MS2标记的RNA的效率（图7A，右）。如所预期的，从pOIP5-AS1-MS2表达的FL RNA显示出与HuR的强结合，但是从p53（pOIP5-AS1-MS2-53）表达的RNA显着减少HuR，表明缺失HuR结合位点强烈减少HuR和OIP5-AS1之间的物理相互作用。使用生物素化的部分RNA分析HuR与OIP5-AS1-MS2-Δ53 RNA的残留结合，确定HuR能够适度地结合该区域。对这一部分的进一步研究揭示了Kishore et al。已经在该区域内鉴定了两个额外的推定的HuR位点。
使用这组表达构建体，我们测试了HuR结合靶mRNA是否受到含有或缺乏HuR结合位点的OIP5-AS1转录物的影响的差异。在HeLa细胞中过表达每种构建体72小时后进行HuR IP;在提取RNA后，使用RTqPCR来定量靶CCNA2，CCND1和SIRT1 mRNA的水平，并且相对于对照IgG IP表示为HuRIP中的倍数富集，除非。当我们过表达FL OIP5-AS1时，与表达空pMS2的细胞（不含OIP5-AS1区段的质粒）相比，HuR与靶mRNA的结合被显着抑制;然而，当代替地表达OIP5-AS1-MS2-53时，该抑制消失，将与靶mRNA结合的HuR的水平恢复至当空pMS2表达时所见的水平（图7B-D）。蛋白质CCNA2，CCND1和SIRT1的表达模式通常遵循结合模式，与OIP5-AS1-MS2-FL相比，蛋白质在表达缺失突变体OIP5-AS1-MS2-Δ53后显示拯救。 OIP5-AS1-MS2-Δ5的过表达导致HuR比其他组更多地结合CCNA2和CCND1mRNA（图7B和C，左）并导致更高产量的CCND1（图7C，右），表明缺失突变体可以选择性地影响不利地影响这些mRNA的调节因子。
总之，HuR与miR-424竞争结合OIP5-AS1; 由于HuR结合OIP5-AS1降低了靶向mRNA的HuR可用性，具有结合HuR的能力受损的OIP5-AS1突变体不能海绵HuR，允许HuR结合靶mRNA并增强其表达。 总之，我们的结果支持一种模型，其中OIP5-AS1的积累可导致HuR的海绵化，将其从靶mRNA上隔离。 相反，当OIP5-AS1丰度下降或由于miR-424的结合而变得不可用时，HuR可用性增加，允许HuR在靶mRNA上引发其转录后功能（图8）。
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参考文献：
Jiyoung K, Kotb A, Xiaoling Y, Supriyo D, Ioannis G, Ji Heon N, Myriam G (2016) “LncRNA OIP5-AS1cyrano sponges RNA binding protein HuR” Nucleic Acids Research 44: 2378-2392
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