作为一名医学生，大多数人在撰写科研论文都会碰到一个难题，科研论文的数据都必须进行统计学处理，上大学时学过的《医学统计学》早已忘得差不多了，重新翻开统计学书本，花上十天半个月的时间，看了后，感觉差不多都会了，还是看得不知所云。今天我们就来复习一下在医学研究中在药物、生物学研究十分普遍的重复测量设计的方差分析(Repeated Measurement Design)吧！
➤最常见的应用情景：
☘ 同一个研究对象给予一种或多种处理后，在多个不同的时点上重复观察获得的指标观察值；
☘ 从同一个个体的不同部位（或组织）上重复获得指标的观测值。
据对临床医学类杂志研究论著的统计，重复测量设计的方差分析使用频率高达 1/4！重复测量设计是对同一因变量进行重复测量的一种试验设计技术。
重复测量的数据与t检验或者随机区组方差分析的区别：
由于同一观察对象在不同时点的观测值之间往往彼此不独立，存在某种程度的相关，因此对重复测量数据如果采取普通的方差分析，不能满足普通的方差分析方法所要求的独立、正态、等方差的前提条件。若采用t检验或者随机区组方差分析，就有可能得出错误的结论！
1统计案例
研究某种药物对某种细胞的细胞活力影响，细胞分为3组：对照组、实验组A、实验组B，分别检测加溶剂、低浓度药物和高浓度药物后4小时、24小时、48小时和72小时的CCK8 OD值。
➔ 不同浓度的药物处理对细胞活力有何作用？
➔ 时间和药物之间是否存在交互作用？
2问题分析
本研究对结局指标进行了多次测量，每个样本的4小时、24小时、48小时和72小时是相关的，这就是常见的重复测量设计。
使用两因素重复测量方差分析(Two-way Repeated Measures Anova)进行分析时，需要考虑3个假设。
❖ 假设1：因变量唯一，且为连续变量；本例因变量只有细胞活力，而且是连续变量。
❖ 假设2：有两个被试内因子（Within-Subject Factor），每个被试内因子有2个或以上的水平。本例的被试内因子内因素为干预因素和时间因素，干预因素即分组处理不同，有两个水平（对照组、实验组） ，时间因素有2个水平（4小时、24小时、48小时和72小时）
❖ 假设3：各时点指标变量满足球形假设(Sphericity 假设)，通常用Mauchly方法检验是否满足球形假设，若检验结果P>0.05，则无需校正；若不满足，SPSS提供三种校正方法对一元方差分析进行校正(校正系数为Epsilon)。
3SPSS操作
➀ 菜单栏点击analyse—General Linear Model—Repeated Measured➙打开重复测量对话框如下图所示：
➁ 出现“Repeated Measures Define Factor”对话框➙在“Within-Subject Factor Name”被试内因子名称中将factor1改为time，因为共测量了4次，所以在Number of Levels中填入4➙点击添加➙接着添加group，一共三组，所以在Number of Levels中填入3➙点击添加，如下图所示：
➂ 点击“Define➙出现“Repeated Measures”对话框 ☟
➃ 在主体内部变量当中的问号分别代表“time”对应的各个水平，将“Control4”、“Control24””、“Control48”等变量一起选入右侧的主体内部变量“Within-Subjects Variables（group，time）”框中，将组别选入右侧“因子列表”框中如下图所示：
➙点击“Plots”➙出现“Repeated Measures：Profile Plots”对话框➙将time添加到Horizontal Axis中➙将group添加到Separate Lines中，
➙点击添加➙出现下图➙点击继续
➙点击选项，回到“Repeated Measures”对话框➙点击“Options”
➙出现 “Repeated Measures: Options”对话框，
把time、group 和group* time一起选入Display Means中，勾选主效应多重比较“Compare main effect”，在Confidence interval adjustment下选择LSD(none)或Bonferroni法进行多重比较；在输出下方勾选“Descriptive statistics”和“Estimates of effect size”，点击“Continue”，
➙回到“Repeated Measures”对话框➙点击“Post Hoc”进入两两比较对话框
把组别选入右侧两两比较检验“Post Hoc Testis for”中，由于本例组别≥3组，还需要勾选复选框“LSD”或Bonferroni法进行两两比较；如果只有2组，不需要设置，点击“Continue”。
解释：如果我们固定时间因素为某一水平，分析分组因素各水平之间的两两差别，即在Repeat Measures的 OPTION 选项里面选择分组因素的 LSD 或者 Bonferroni 校正。
回到“Repeated Measures”对话框，点击OK。
☞单独效应分析SPSS操作
➤ 在主菜单下点击Analyze > General Linear Model > Repeated measures
➤ 出现Repeated Measures Define Factor(s)对话框，如下图所示：
➤ 单击time(4)，点击Remove按钮，在Number of Levels：只剩group，如下图所示：
➤ 点击Define，出现下图Repeated Measures对话框；Within-Subjects Variables后面的括号内是group的名字，将左侧Control4、A4、B4变量均选入右侧框中，如下图所示：
➤ 点击Options，出现Repeated Measures: Options对话框，如下图所示：
➤ Display下方去掉勾选Deive statistics，点击Continue，点击OK。
➤ 第二组分析24小时group的单独效应重复上述操作，将步骤5中将Control24、A24、B24选入右侧框中；第三组分析48小时group的单独效应重复上述操作，将步骤5中将Control48、A48、B48选入右侧框中; 第四组分析72小时group的单独效应重复上述操作，将步骤5中将Control72、A72、B72选入右侧框中。
4结果解释
Descrpitive Statistics表给出了均值、标准差和例数，从该表可以看到，随着时间推移，对照组和两个处理组的细胞活力。
在判断两个被试内因子（时间因素和药物因素）是否存在交互作用前，需要先判断两个被试内因子是否符合球形假设。在Mauchly's Test of Sphericity表中，给出了球形假设的检验结果。本案例中球形检验结果P=0.007<0.05，数据不满足球形假设，需校正。
然后看多元方差分析结果和Test of Within-Subjects Effects表（主效应方差分析）的结果。主效应即重复测量的各个时间点，该表是时间因素主效应及时间因素与分组因素交互效应的方差分析结果，若 P＞0.05，满足球形假设，无需校正；若P≤0.05，则不满足球形假设，需用Epsilon校正系数来校正自由度。表中列出3种校正系数，分别是Greenhouse Geisser、Huynh-Feldt和下限Epsilon校正系数，一般选择Greenhouse Geisser。本例P=0.007，由于time单独效应不满足球形分布假设，故选择Greenhouse Geisser校正的结果。不同干预处理之间细胞活力有统计学差异（F=229.432，P＜0.001），时间与各组之间的交互效应有统计学意义 （F=10.162，P＜0.001），说明时间因素（即4小时、24小时、48小时、72小时）对细胞活力的作用会随着分组（对照组、实验组A、实验组B）的不同而不同, 应分析各组的单独效应。
注：当不存在交互作用时，说明两因素的作用效果相互独立，逐一分析各因素的主效应即可。
与细胞活力检测结果相同
由于时间与各组之间的交互效应有统计学意义, 应分析各组的单独效应。
检验group的单独效应是指在不同时间水平比较干预试验和对照试验中处理因素导致的细胞增殖差异，需要三次单独的比较，如下图所示。
❶Control4、A4和B4的比较结果
当只有三个组比较时，需要满足球形假设。如下图所示，P=0.240，大于0.05，所满足球形假设。
Tests of Within-Subjects Effects表是对因变量进行二元方差分析的结果。P<0.05时，自变量对因变量的影响存在统计学意义；P≥0.05时，自变量对因变量的影响不存在统计学意义。该表给出了研究开始4小时group对因变量的单独效应，分组对OD值的影响不具有统计学意义 (F=1.913, P=0.261)。
❷ Control24、A24和B24的比较结果
P=0.369，大于0.05，满足球形假设。
满足球形假设以后，看Tests of Within-Subjects Effects表如下图所示，该表给出了24小时时group对因变量的单独效应，group对OD值的影响具有统计学意义 (F=23.651, P=0.006)。
然后在Pairwise Comparisons表中看Control24、A24和B24的两两比较结果，在24小时A组中研究对象的OD值比对照试验的低0.010(95%置信区间：-0.019 - 0.001)OD值，差异具有统计学意义，P=0.041。在24小时B组细胞的OD值比对照试验的高0.037(95%置信区间：0.001 - 0.073)OD值，差异具有统计学意义，P=0.047。
检验time的单独效应是指在不同组中比较时间因素给OD值带来的差异。group有3组，所以需要做3次比较，如下图所示。
做这些比较与做3次单因素重复测量方差分析相同，需要做的3次比较分别为：Control4、Control24、Control48 、Control72一组，A4、A24、A48 、A72一组和B4、B24、B48 、B72。time的单独效应与上述group的单独效应SPSS操作相似，由于细胞活力随时间的变化不是本例研究目的，在此不做赘述。
5论文表述
➀ 当干预因素和时间存在交互作用时
CCK8测得的数据采用两因素重复测量方差分析方法，判断不同干预措施随着时间的变化对细胞活力OD值的影响。数据以均数±标准差的形式表示。
group和time的交互作用对OD值的影响有统计学意义（F=10.162，P＜0.001）。因此，对group和time给细胞活力的作用进行单独效应的检验。
在加药后4小时，对照组(0.139 ± 0.002)与实验组A(0.130 ± 0.002)、 实验组B(0.135 ± 0.009)的细胞活力差异不具有统计学意义(F=1.913, P=0.261)。
在24小时，对照试验(0.252 ± 0.011)与实验组A(0.262 ± 0.014)、实验组B(0.215± 0.009)的细胞活力差异具有统计学意义，A组中研究对象的OD值比对照试验的低0.010(95%置信区间：-0.019 - 0.001)OD值，差异具有统计学意义，P=0.041。在24小时B组中研究对象的OD值比对照试验的高0.037(95%置信区间：0.001 - 0.073)OD值，差异具有统计学意义，P=0.047。
在48小时，对照试验(0.466 ± 0.059)与实验组A(0.550 ± 0.036)、实验组B(0.215± 0.009)的细胞活力差异不具有统计学意义(F=6.903, P=0.050)。
在72小时，对照试验(0.252 ± 0.011)与实验组A(0.262 ± 0.014)、实验组B(0.215± 0.009)的细胞活力差异具有统计学意义，A组的OD值比对照试验的低，差异没有统计学意义，P=0.674。B组的OD值比对照试验的高，差异具有统计学意义，P=0.018。
➁ 当时间和干预因素不存在交互作用时
采用两因素重复测量方差分析方法，判断不同干预措施随着时间的变化对细胞活力的影响。经Mauchly's球形假设检验，对于交互项group*time，服从球形假设(P>0.05)。数据以均数±标准差的形式表示。
group和time的交互作用对细胞活力的影响无统计学意义。因此，需要解读两个被试因子 (group和time)的主效应。
group对细胞活力的主效应具有统计学意义，F=229.432，P＜0.001。干预试验中低浓度药物组比对照组的OD值高0.029(95%置信区间： 0.049 ~ 0.009)，差异具有统计学意义，P=0.026。高浓度药物比对照组的OD值低0.101(95%置信区间：-0.078 ~ -0.125)，差异具有统计学意义，P=0.003。
以上就是做重复测量设计的方差分析的全部过程，你学会了吗？
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