自然杀伤T细胞NKT细胞是特化T细胞的异质子集，这些细胞显示出先天的细胞样特征，即对抗原暴露快速反应，再加上适应性细胞对抗原识别的精确性和多样化的效应反应。NKT细胞的优势在于具有同时激活各种效应细胞类型的潜力，包括CD8+T和NK细胞，进而消除MHC阳性和MHC阴性的肿瘤细胞。此外，激活的NKT细胞可以在其激动剂配体存在的情况下与未成熟的DC相互作用，诱导DC成熟，从而克服癌症患者中常见的免疫缺陷状态，并建立长期的抗肿瘤免疫。因此，NKT细胞靶向治疗被认为是抗癌和预防肿瘤复发转移的理想治疗方法。此外，由于NKT细胞配体是由单态CD1d分子提出的，该配体本身可以作为一种药物用于任何患者，无论他们的HLA单倍型是什么。由于NKT细胞靶向免疫治疗的抗肿瘤作用在很大程度上依赖于激活患者自身免疫系统中的其他固有免疫细胞和获得性免疫细胞，这些细胞理论上含有肿瘤特异性效应细胞的克隆，但由于肿瘤细胞介导的免疫抑制机制，这些细胞克隆不能被有效激活，因此NKT细胞靶向治疗可以利用免疫系统来对抗任何类型的肿瘤。像传统的T细胞一样，NKT细胞经历胸腺的发育和选择，并拥有识别抗原的T细胞受体(TCR)。然而，与传统T细胞不同的是，NKT细胞表达的TCR识别由保守的、非多态性的MHC-1类分子CD1d(11)提供的脂类抗原。除了TCR，NKT细胞还具有细胞因子受体，如IL-12、IL-18、IL-25和IL-23，类似于天然细胞如NK和天然淋巴细胞。即使在没有TCR信号的情况下，这些炎性细胞因子的稳定表达也可以激活这些细胞因子受体。因此，NKT细胞可以融合TCR介导的刺激和炎性细胞因子的信号，以显示一系列细胞因子的迅速释放NKT细胞是CD1d限制性的先天类T细胞，同时表达T细胞受体和NK细胞标志。人和小鼠的主要NKT细胞群是恒定NKT(INKT)细胞，而iNKT细胞最广为人知的功能是其强大的抗肿瘤功能。自从25年前被发现以来，iNKT细胞的原型配体α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)已经被用于30多项抗肿瘤临床试验，但大多效果不佳。为了实现其治疗潜力，已经开发了许多临床前模型来优化基于α-GalCer的癌症免疫治疗的方案和策略。然而，目前还没有标准的α-GalCer给药方案，其中最引人注目的是用人源化CD1d/iNKT细胞系统生成新的小鼠模型。随着新的iNKT细胞配体的不断出现，新的α-GalCer递送策略的发明，以及用于优化这些新策略的显著改进的临床前模型，人们有望在不远的将来实现α-GalCer的全部抗肿瘤潜力。
自然杀伤T细胞(Natural Killer T，NKT)是CD1d限制性的先天类T细胞，同时表达T细胞受体和NK细胞标记。恒定NKT(INKT)细胞是人类和小鼠NKT细胞的主要群体。它们分别在人和小鼠体内表达恒定的Vα24-Jα18链和Vα14-Jα18α链。从20世纪90年代初发现iNKT细胞以来，研究最多的就是它们的抗肿瘤功能。激活的iNKT细胞迅速分泌Th1和Th2细胞因子，并激活NK和其他免疫细胞，以刺激抗肿瘤免疫反应。典型的iNKT细胞配体为α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，为1994年次从海绵Agelas mauritianas中分离得到的鞘磷脂。注射游离α-GalCer的小鼠对转移性B16黑色素瘤细胞表现出很强的抗肿瘤活性。目前公认的是α-GalCer的抗肿瘤特性是由CD1d限制的iNKT细胞介导的。
α-GalCer对实验小鼠的抗肿瘤免疫作用
尽管有大量文献报道了α-GalCer和iNKT细胞的抗肿瘤功能，但目前还没有建立起传递iNKT细胞配体的标准程序。程序在不同的研究小组之间差别很大。糖脂配体可以在肿瘤细胞接种之前、同时或之后在不同的时间点通过静脉、腹腔或皮下途径以及以自由或运输的形式给药。显然，糖脂注射的方案、时间点、路线和形式都对随后的免疫反应有重大影响，因此对结果的解释也有重大影响。
在最初关于α-GalCer[KRN7000，与原始AGL9b的类似物]抗肿瘤功能的报道中，糖脂是在B16细胞接种后注射的。Morita等人报道了皮下接种B16细胞1、5、9d后注射α-GalCer对肿瘤体积的抑制作用约为50%。肿瘤接种前的糖脂治疗是一种预防性治疗，可能特别适用于未来特定肿瘤抗原的肿瘤疫苗接种，而肿瘤后接种研究更多的是临床上与抗癌治疗相关的研究。
提高α-GalCer抗肿瘤效果的途径
α-GalCer在抗肿瘤临床试验中疗效不佳的可能机制有很多种，例如诱导无能，iNKT细胞分泌Th1和Th2型细胞因子，以及肿瘤在微环境中的免疫抑制。在抗肿瘤临床试验中，已经提出了许多可能的机制，如诱导无能，iNKT细胞分泌Th1和Th2型细胞因子，以及肿瘤在微环境中的免疫抑制。许多新的α-GalCer类似物被设计用来提高Th1/Th2比值，增强抗肿瘤免疫。
抑制iNKT细胞无能诱导的途径
Fujii和Van Kaer小组的开创性工作证明了α-GalCer激活iNKT细胞后诱导的长期无能。无能诱导不仅使iNKT细胞的进一步激活效率低下，而且在糖脂的进一步刺激下，无能的iNKT细胞实际上会加剧肿瘤的发生。到目前为止，克服iNKT细胞无能的最好方法是将α-GalCer装载到树突状细胞。虽然负载DC的α-GalCer后Th1/Th2型细胞因子的绝对量没有游离α-GalCer高，且细胞因子的分泌呈延迟动力学，但DC载体的α-GalCer对分泌细胞因子的脾细胞有较高的刺激作用。重要的是，DC负载的α-GalCer不会导致iNKT细胞无能。更重要的是，在B16黑色素瘤模型中，DC载体α-GalCer显示出比游离α-GalCer更强的抗肿瘤活性。特别值得注意的是，在DC载体的α-GalCer中，NK细胞只负责大约一半的抗肿瘤作用，而它们几乎占据了α-GalCer介导的全部游离抗肿瘤功能。鉴于DC载药α-GalCer已广泛应用于抗肿瘤临床试验，进一步阐明DC载药α-GalCer的确切抗肿瘤机制具有重要意义。
第二种报道的抑制NKT细胞无能的方法是使用负载α-GalCer的外泌体。虽然在早期的临床试验中，负载肿瘤抗原的外泌体大多是耐受的，几乎没有免疫刺激作用，但作为免疫刺激佐剂，负载α-GalCer的外泌体在小鼠体内产生了有效的抗肿瘤反应。使用皮下B16黑色素瘤模型，Gehrmann等人的结果表明，α-GalCer负载树突状细胞来源的外泌体能有效抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期。更重要的是，在第一次注射后一周再次注射加载的外泌体可以进一步抑制肿瘤的生长，这表明第一次注射α-GalCer加载的外泌体不会引起无能。
在分子水平上恢复NKT细胞的活力是抑制NKT细胞无能的第三种方法。最初针对癌症NKT细胞的研究的一个主要局限性是，这些研究是使用单一药物策略进行的，没有考虑免疫检查点或其他免疫抑制因素的阻断。PD-1/PD-L通路在介导αGalCer诱导的NKT细胞无能中起重要作用。在α-GalCer治疗时，抗体介导的阻断PD-1/PD-L相互作用可阻止INKT无能的诱导，并增强αGalCer的抗肿瘤活性。因此，应考虑将NKT靶向治疗与PD-1/D-L阻断相结合。基于MHC结合肽表位与α-GalCer偶联的合成脂肽疫苗在黑色素瘤模型中显示出良好的抗肿瘤活性。IL-2对iNKT细胞具有抗无能作用。鉴于其在打破常规T细胞无能的功能，Parekh等人使用IL-2在体外和体内均能再次刺激无能iNKT细胞增殖，而IL-12、IFN-γ和IL-4无此作用。
α-GalCer增强抗肿瘤作用的新途径
肿瘤细胞或肿瘤抗原与α-GalCer复合免疫。将α-GalCer装载到肿瘤细胞进行免疫，即使对于低免疫原性的肿瘤细胞，包括B16黑色素瘤细胞，α-GalCer负载的肿瘤细胞一次免疫也能激发强大的肿瘤特异性T细胞应答。记忆CD4和CD8T细胞可保护免疫小鼠免受肿瘤再攻击达6~12个月。研究还表明，CD1d的表达显著提高了iNKT细胞为基础的治疗的疗效，这可能是由于iNKT细胞的直接杀伤效率增加所致。因此，肿瘤细胞上CD1d的表达可以作为未来iNKT细胞临床治疗的阳性生物标志物。负载α-GalCer的树突状细胞主要诱导基于天然免疫的非特异性抗肿瘤反应，包括活化的NK细胞，而负载α-GalCer的肿瘤细胞则诱导更特异的基于长期适应性免疫的抗肿瘤反应。
其他几个小组已经探索了用α-GalCer运送肿瘤细胞或特定肿瘤抗原的载体，如树突状细胞，树突状细胞来源的外泌体，负载肿瘤来源外泌体的树突状细胞，PLGA纳米颗粒，阳离子脂质体，化学偶联的α-GalCer-肿瘤肽抗原复合疫苗，或α-GalCer负载的重组可溶性CD1d蛋白与单链抗体融合。在体内，肿瘤抗原由内源性树突状细胞直接或交叉提呈给CD8+T细胞，而共递送的α-GalCer则提呈给iNKT细胞。正如预期的那样，所有这些方法都显示了增强的肿瘤抗原特异性CTL反应和这些T细胞中干扰素-γ的分泌。这些方法已经证明对接种肿瘤疫苗的挑战既有预防作用，也有治疗作用。一个阶段的试验已经完成，使用负载α-GalCer的树突状细胞和公认的新抗原NY-Eso-1。令人鼓舞的是，在大多数患者(51例)中，NKT细胞增殖、NKT细胞相关细胞因子分泌增加，更重要的是，循环中的NY-ESO-1特异性T细胞增加。
增强α-GalCer抗肿瘤功能的多种途径
众所周知，CD4+CD25+Treg细胞抑制抗肿瘤免疫。另一方面，一些报道显示α-GalCer激活的NKT细胞分泌IL-2导致Treg细胞的增殖。在B16黑色素瘤细胞皮下攻击模型中，在α-GalCer疫苗接种前2天预先注射耗竭的抗CD25McAb(PC61)可增强α-GalCer诱导的预防性抗肿瘤功能。然而，在肺癌细胞株Tc1的治疗性肿瘤攻击模型中，在α-GalCer治疗前预先给予相同的α-GalCer抗体并不能增强其抗肿瘤功能。有趣的是，在彼得森报告中，α-GalCer挑战和NKT细胞激活并没有像先前报告的那样诱导Treg细胞的扩张。这种差异可能是由于α-GalCer交付的不同路线造成的。。需要更多的研究来描述iNKT细胞和Tregs之间的相互作用，以便操纵Tregs以利于iNKT细胞介导的癌症治疗。
干扰素-γ是继α-GalCer后的主要细胞因子效应因子之一。高剂量的干扰素-γ诱导免疫抑制因子，包括诱导型一氧化氮合酶，它产生一氧化氮并抑制抗肿瘤免疫。在使用诱导型一氧化氮合酶抑制剂L-NAME治疗的诱导型一氧化氮合酶基因敲除小鼠或野生型小鼠中，次优的α-GalCer治疗(接种B16黑色素瘤7天后的单一治疗)能更有效地抑制B16转移。另一项研究表明，当小鼠同时使用全反式维甲酸时，α-GalCer的次优治疗也能显著抑制B16黑色素瘤的肺转移。维生素A衍生物全反式维甲酸(ATRA)可诱导CD11b+Gr-1+未成熟髓系细胞分化，并降低这种主要产生一氧化氮的细胞数量。
总之，化学、药剂学和免疫学领域的研究人员的共同努力将带来更强大的α-GalCer类似物、优化的给药和治疗方案以及极大改进的临床前模型。预计在不久的将来，基于α-GalCer的癌症免疫疗法将充分发挥其在临床上的潜力。
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