看点：如何论证HOXA11-AS是作为“支架”在染色质的转录复合体中调控PRSS8 和 KLF2的表达。
关键词：（核心分子互作技术研究转录复合体）
RNA pull-down：RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull-down使用体外转录法获取生物素标记的RNA探针，然后与细胞蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物，通过链霉亲和素吸附生物素的方法获取RNA-蛋白复合物，从而达到富集特异结合靶标RNA的蛋白的目的。
RIP：RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA结合蛋白免疫沉淀，是研究细胞内RNA-蛋白复合物的技术，是通过RNA结合蛋白的抗体孵育细胞蛋白提取液来获取RNA-蛋白复合物，后续一般通过qRT-PCR方法检测RNA-蛋白复合物中的RNA序列。
ChIP: 染色质免疫沉淀技术（ChIP，Chromatin Immunoprecipitation Assay）使用转录复合体相关蛋白的抗体，通过与细胞核裂解物孵育共沉淀DNA-蛋白质-RNA转录复合物，后续通过qPCR技术检测DNA片段，确定转录复合体结合的基因组DNA序列。
结论：
在胃癌细胞中，作者通过RIP与RNA pull-down技术，两方面验论证了lncRNA与蛋白互作的情况。并进一步确定了lncRNA与蛋白结构域互作的具体对应关系。
数据库分析挖掘了与HOXA11-AS互作的蛋白EZH2, LSD1, DNMT1, AGO2,和 STAU1等，这些基因有些是转录复合体重要转录因子，进而作者进行了实验验证。
通过转录水平RNA-Seq结果分析预测HOXA11-AS相关转录复合体调控的下游基因PRSS8 ，KLF2，SOX15,CDH16,GDF15,P21等，并验证了转录复合体与基因组启动子序列的结合情况。
综合数据总括得：胃癌细胞中HOXA11-AS作为PRC2/LSD1/DNMT1的支架形成了转录复合体共同调控 PRSS8 和 KLF2 的表达。
结果展示如下：
A：细胞生物学方面的lncRNA亚细胞器定位
作者针对BGC823, SGC7901, 和 MGC803三个细胞系进行FISH实验，鉴定HOXA11-AS在胃癌细胞的分布情况，绿色荧光为HOXA11-AS，蓝色荧光为DAPI。通过图像分析发现：HOXA11-AS主要分布在胃癌细胞的细胞核中。
B：分子生物学方面的蛋白复合体中的ncRNA存在种类鉴定
作者可能通过RNA-蛋白质相互作用预测的数据库（如:http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/）筛选到HOXA11-AS可能与EZH2, LSD1, DNMT1, AGO2, and STAU1等蛋白有相互作用关系。
然后分别针对BGC823, SGC7901细胞系进行捕获EZH2, LSD1, DNMT1, AGO2,和 STAU1等蛋白复合体的RIP实验。后续qPCR检测HOXA11-AS数据证实了：EZH2, LSD1, DNMT1, WDR5, STAU1, 和AGO2等蛋白与HOXA11-AS这个lncRNA存在相互作用关系。
C：分子生物学方面的ncRNA和蛋白互作的种类鉴定
作者通过外源标记生物素的HOXA11-AS RNA探针对胃癌细胞裂解物进行pull-down实验（亲和沉淀），作者通过在数据B的结果中筛选的与HOXA11-AS相互作用可能性较大的LSD1，AGO2，EZH 2蛋白进行WB检测验证（其中AR做 pull-down实验WB检测HUR作为阳性对照增加实验的可靠性）。
WB结果发现：HOXA11-AS与LSD1，AGO2，EZH2蛋白存在相互作用关系。
#C中的RNA Pulldown实验与B中RIP实验相结合增加了实验的严谨性与数据的可靠性，逻辑学角度是正命题证明与逆命题证明的关系。
D：作者提出假设：HOXA11-AS是作为一个“支架”与LSD1和 EZH2相互作用的，
LSD1和 EZH2本不是相互作用的，在lncRNA HOXA11-AS存在的情况下才产生互作。
针对LSD1和 EZH2蛋白的RIP实验，qPCR分别检测HOXA11-AS-D1和HOXA11-AS-D2。数据分析发现：与对照组比较EZH2主要结合在HOXA11-AS-D1(1-856 nt)，而LSD1主要结合HOXA11-AS-D2(857-1565 nt)。
为证实这一假设，作者克隆了HOXA11-AS的两个重要片段：HOXA11-AS-D1(1-856 nt) 和HOXA11-AS-D2(857-1565 nt)装入表达载体pcDNA构建克隆后，分别转染到AGS细胞系中构建两套lncRNA过表达细胞系。
针对lncRNA裁切片段过表达的两套细胞系，进行LSD1和 EZH2蛋白的RIP实验，论证了：EZH2主要结合在HOXA11-AS-D1(1-856 nt)，而LSD1主要结合HOXA11-AS-D2(857-1565 nt)。
E：论证的严谨性，作者又进行了针对截短型HOXA11-AS-D1和HOXA11-AS-D2的pull-down实验，得到的数据与D数据分析结果中 EZH2主要集中结合在HOXA11-AS-D1(1-856 nt)，而LSD1主要集中结合在HOXA11-AS-D2(857-1565 nt)的结果相吻合。
A~E：中作者主要通过RIP与RNA pull-down实验挖掘并证实了HOXA11-AS是作为EZH2和LSD1的“支架”起相互作用的。
F-G: 接着作者将针对HOXA11-AS去挖掘其调控相关下游的重要靶基因。
F：生信方法数据挖掘基因表达数据库获得与lncRNA调控的候选基因
作者通过RNA-sequencing分析得到跟HOXA11-AS 相关的下游基因 PRSS8 ，KLF2，SOX15,CDH16,GDF15,P21等。
G：通过构建siRNA细胞系确定lncRNA与候选基因的表达相关性
在BGC823细胞系中qPCR检测PRSS8 ，KLF2，SOX15,CDH16,GDF15,P21等基因的表达水平。
在si-HOXA11-AS-SGC7901细胞系中qPCR检测PRSS8 ，KLF2，SOX15,CDH16,GDF15,P21等基因表达水平，初步筛选出在胃癌中高表达且敲减HOXA11-AS后跟空白对照组比有显著性差异的基因PRSS8 和KLF2。
再在BGC823,SGC7901,MGC803三个细胞系中做si-HOXA11-AS敲减实验后与空白对照组比较WB检测PRSS8 和KLF2的蛋白表达水平变化，通过灰度值计算数据得出在胃癌细胞中敲减HOXA11-AS后上调控 PRSS8 和KLF2的表达。
#生信方法挖掘通路调控基因 构建siRNA细胞系检测候选基因扰动情况 相关性分析=lncRNA下游调控网络的基本套路。
H: 与明星基因DNMT1关系的鉴定
作者在BGC823,SGC7901两个细胞系中分别做了敲减 DNMT1，EZH2和LSD1后检测PRSS8 和 KLF2 mRNA的表达水平情况，数据分析得到在BGC823,SGC7901细胞系中与空白对照组比较，敲低DNMT1后会显著增加KLF2的mRNA的表达。
敲低LSD1显著增加PRSS8的mRNA的表达。
敲低EZH2显著增加KLF2和PRSS8的mRNA的表达。
这表明极有可能EZH2和DNMT1共同调控KLF2的表达，而EZH2和 LSD1共同调控PRSS8的表达。
I: 染色质转录调控复合体成员筛查
作者在BGC823和SGC701细胞系中分为敲减与未敲减HOXA11-AS两组对照实验，通过PRSS8的ChIP实验qPCR检测EZH2,H3K27me3,LSD1,HK4me2;KLF2的ChIP实验qPCR检测EZH2,H3K27me3，DNMT1。
数据分析得到在未敲减HOXA11-AS实验组中DNMT1 能与KLF2的启动子区结合；EZH2能与PRSS8/KLF2的启动子区结合并能诱导H3K27me3修饰；LSD1能与PRSS8的启动子区结合并会调节H3K4的脱甲基化，
敲减HOXA11-AS后则降低了转录调控复合体在胃癌细胞基因调控位点中的结合能力和诱导修饰能力。
材料来源：Cancer Research 2016
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