自circRNA首次在拟南芥中报道后，植物circRNA中的研究便拉开序幕。今天要分享的文章是一篇早期植物circRNA鉴定的文章，题目是Widespread noncoding circular RNAs in plants。该篇文章发表于New Phytologist（影响因子7.33），ISI期刊引文报告排名：9/211（植物科学）。
背景：
1. 早在上世纪，陆续有报道显示真核细胞中环状 RNA 的存在，但在当时被认为是剪切错误的产物。随着高通量测序技术和生物信息学分析的发展，Salzman 等人首次指出环状 RNA 由 mRNA 前体可变剪切得来，是一类 3’ 与 5’端共价闭合，广泛大量存在于真核生物体内的内源性RNA，参与转录后调控过程。
2. circRNA形成的模型如图1所示，在转录过程中发生head-to-tailsplicing （back splicing），当剪切体两端自身发生互补配对时，则转录出circRNA。
3. 根据来源，circRNA可以分为三类：外显子、内含子和基因间区域circRNA.
4. 在人类的研究中，circRNA环化过程具有以下特征：
a. 相邻长的内含子序列中通常富集ALU重复片段.
b. 侧翼内含子具有反向互补的特征.
c. RNA结合蛋白Quaking参与调控circRNA的形成。
5. circRNA能够组织时空特异性表达，且能够通过miRNAsponges实现调控功能。
Fig 1 A model showing linear and backsplicing for generating linear mRNA and circRNA, respectively.
材料与方法：
1. 数据来源：O.sativa根部(GenBank accession PRJNA215013; read length 101 bp)；A. thaliana叶片(PRJNA218215; read length 100 bp).
2. 使用 BOWTIE2 (v2.0.5)获得未比对到参考基因组上的RNA测序序列，提取首尾20-nt再次比对到参考基因组找寻唯一的接头（anchor）位置，并通过侧翼剪切位点GU/AG来确定circRNA的候选序列。每一个候选circRNA至少包含两个独立的反向剪切序列。（图2）
Fig 2 The pipelinefor computational identification of circRNAs in plants following the methodused in animals (Memczak et al., 2013)
3. circRNA的实验验证：简单来说，作者通过发散性引物（divergentprimers）在DNA和cDNA模板上扩增信息的不同来验证circRNA的存在。PCR条件详见文章。值得一提的是，实验对象是参照下载数据的文章所述相同条件和部位。同时，为了验证下载数据的真实性，作者采用相同条件种植水稻，并取相同部位进行扩增实验。
4. Blast用于序列保守性分析，GO富集分析用于序列功能注释，MEME用于侧翼内含子中5-60nt 保守基序的鉴定。
5. 表达分析采用FPKM算法计算，通过Pearson correlation coefficien判断circRNA与来源基因的共表达相关性。
结果：
1. 对鉴定的数据进行描述，包括circRNA的数量、来源分类，见表1。水稻和拟南芥中有 12037 和 6012 个环状 RNA，其中外显子circRNA数量较多。同时，作者从中随机选取 (10/18) 个高表达的外显子circRNA进行PCR扩增实验结果验证测序结果。
Table 1 Genome-wide identification ofcircular RNAs (circRNAs) in plants based on RibominusSeq data
UTR, untranslatedregion
aOther circRNAs refer to those derived fromtwo or more genes.
2.比对分析了水稻和拟南芥中鉴定circRNA的同源性，其中直系同源对数目超过700，其中超过 300 个直系同源亲本基因的环状 RNA 均来自于基因组相同位点，如图3例子所示。
Fig 3 An example showing conservation of exoniccircRNAs.
3. 根据动物circRNA研究基础，分析植物中circRNA侧翼序列结构特征，发现植物外显子circRNA侧翼内含子序列并不富含重复和反向互补序列。同时，在水稻和拟南芥的circRNA中，未发现保守的侧翼内含子序列。相较于动物，植物circRNA侧翼内含子要长于线性基因的。
4. 磷处理下水稻根部circRNA表达与其来源基因的相关性分析发现349对具有显著正相关，且暂未发现呈负相关的组合。不同处理下的水稻circRNA的表达不尽相同，说明其表达具有一定时空特异性。其中，27个外显子circRNA在响应磷胁迫中发挥功能。
5. 通过对产生circRNA的基因组区域是否包含miRNA结合位点来预测circRNA分子靶miRNA，发现只有小部分的circRNA分子具有miRNA结合位点，其中水稻5.0%，拟南芥6.6%.
小结：
作者选用植物中最基本的研究对象展开circRNA的研究，涵括单子叶及双子叶植物，通过对比动物研究，初步得到植物circRNA同样具有特异性时空组织表达的特性，其表达与来源基因相关，且序列保守。但在circRNA形成模式上，植物与动物间的特征并不相同，如侧翼序列的重复片段、内含子长度等方面。结果显示，circRNA在植物生长过程中同样起到重要作用，值得深入研究。
该篇文章把握了当下研究热点，为植物circRNA的鉴定研究提供了一个研究模板。下一篇我们将继续分享NP中发表的另一篇circRNA研究的文章，学习优秀文章的研究策略。
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