间充质干细胞冻干粉制备方法

发布时间：2019/3/8   来源：《中国医学人文》2018年第10期   作者：杨前1,2 张宜1,2 陈力1,2 袁紫林1,2 王

[导读] 如蛋白质、微生物类不会发生变性失活，易于氧化的物质得到保护，低温保存可长达2年，有利于开展其他各项试验研究[6]。

（1中国人民解放军武汉总医院医学实验科;武汉市430070 ；2湖北省中枢神经系统肿瘤与干预重点实验室;武汉市430070 ；深圳新一仑生物科技有限公司）

【摘要】目的 探讨脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法。方法：通过原代培养干细胞，传代、分离； FACsAria流式细胞仪检测干细胞特征；SCIENTZ-12N冷冻干燥机将细胞因子制备成冻干粉；结果：流式细胞术检测到干细胞高表达共性标志CD73及CD29蛋白；脐带间充质干细胞冻干粉制备成功；结论：通过使用SCIENTZ-12N冷冻干燥机对干细胞上清液进行若干小时冷冻干燥处理，能得到较好质量干细胞冻干粉；

【关键词】干细胞；冻干粉；流式细胞术；

Study on the preparation of lyophilized mesenchymal stem cells

[Abstract] Objective: to explore the preparation method of umbilical cord mesenchymal stem cells lyophilized powder. Methods: Stem cells were cultured, subcultured and isolated in primary culture, the characteristics of stem cells were detected by FACsAria flow cytometry, the cell supernatant was prepared into freeze-dried powder by Ningbo Xinzhi SCIENTZ-12N freeze-dryer. Results: high expression of CD73 and CD29 proteins were detected by flow cytometry. The umbilical cord mesenchymal stem cells were prepared successfully. Conclusion: The stem cell supernatant can be freeze-dried for several hours by using Ningbo Xinzhi SCIENTZ-12N freeze-dryer to obtain high quality stem cell freeze-dried powder.

[Keywords] stem cells; lyophilized powder; flow cytometry;

【中图分类号】R2　　　　【文献标号】A　　　　【文章编号】2095-9753（2018）10-0028-02

MSC是目前研究热点，许多临床试验已证实MSC能够治疗多种疾病，并具有较好效果，而干细胞分泌的细胞生长因子是一种多功能强力细胞活性因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能；在体内的含量极微，但是具有很高的生物活性；能够促进和调控皮肤细胞的分裂、增殖和分化，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润，堪称人体的青春因子[1]。但是细胞因子的生物活性存在时效性的特点，随着保存时间延长，生物活性会逐渐减退消失，影响细胞因子功能；

鉴于此，本课题组参考生物制剂蛋白抗体的保存方法，以及某些其他剂型易失活而广泛制备成冻干粉剂的药品保存方法[2];通过前期干细胞因子的生物活性的研究实验，尝试将干细胞生物活性因子制备成冻干粉剂，使用时用配套溶酶溶解，由于冻干剂在干燥后形态疏松，物理理化性质基本不发生变化，加入溶酶后能够快速溶解并恢复原有细胞因子培养液的生物活性，这样在4℃或者-20℃能长期保存，最大程度上保护了细胞因子的生物活性，延长保存期限。

1、材料与方法

1.1 仪器及试剂

间充质干细胞无酚红培养基、0.1%胰蛋白酶/柠檬酸消化液均购自天津灏洋生物制品科技有限公司；青霉素、链霉素购自美国Hyclone公司；医用生理盐水购自武汉滨湖双鹤药业

有限责任公司；0.22μm无菌滤膜购自Salus公司；CD31-FITC、CD73-PE、HLA-DR-Per-CP、

第一作者：杨前，女，硕士，武汉总医院医学实验中心，技师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究，

通讯作者：刁波，男，博士，硕士生导师，武汉总医院医学实验中心，副主任

CD29-APC、CD81、CD63抗体均购自BD公司；精宏水浴锅（XMTD-8222）；低速离心机（飞鸽TDL-80-2B）、高速冷冻离心机（Anke-GL-21B）;生物安全柜(苏净安泰生物)；CO2培养箱(Sanyo-mco-18AIC)；倒置显微镜(日本Olympus)；冷冻干燥机（SCIENTZ-12N，宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 脐带间充质干细胞培养

无菌提取剖宫产胎儿脐带，在生物安全柜内用含有双抗的生理盐水清洗脐带3-5遍，将残存血块清洗干净，脐带呈现纯白色，然后用无菌手术剪及手术镊剔除脐带动脉、脐静脉和外包膜，并将其剪碎至1mm3大小，尽量多的分离出脐带中的沃顿胶（Wharton’sjelly），然后均匀接种于150mmBD无菌培养皿中，加入含有5％干细胞添加剂的干细胞培养液置饱和湿度的37℃、5％CO2培养箱内培养。每3-5天更换1次新鲜干细胞培养液。大约10天左右即有成纤维状细胞呈集落状爬出，待细胞集落融合率到达80％左右时，即可使用0.1％胰蛋白酶/柠檬酸消化液消化传代，取生长状态良好的P3～P6代细胞进行实验。

1.3 流式细胞仪鉴定huc-MSCs

用0.1％胰蛋白酶/柠檬酸消化液将生长状态良好的MSC细胞消化下来，用50μlPBS混悬，然后分别加入10μlCD31-FITC，10μlCD73-PE，10μlDRPer CP，5μlCD29-APC，避光孵育15min,用PBS清洗一遍，后1000rpm/min，离心5min,沉淀用500μlPBS重悬后，上流式细胞仪检测分析。

1.4 huc-MSCs细胞活性因子冻干粉制备

选择细胞状态良好、增殖能力强的P3~P6代人脐血间充质干细胞上清液收集至3ML无菌西林瓶中，放置-80℃低温冰箱中冻存至固体状，然后将固体状培养基放置预设置好参数的冷冻干燥机中，冷冻干燥8-24小时，待样品完全冻干至粉末状，放置-80℃低温冰箱中长期保存；

2、结果

2.1 hUC-MSCs流式检测

经过流式检测得到P4代次的人脐带间充质干细胞呈现CD73(+)、CD29(+)、CD31(-)、HLA-DR-Per-CP(-)纯度和活性都比较高的间充质干细胞特点;见(图1)。

图2、干细胞冻干粉制备曲线图

3、讨论

近年来，间充质干细胞移植治疗多种疾病的研究报道越来越多，临床治疗心肌损伤性疾病、神经损伤性疾病研究等等，其中也有很多关于干细胞治疗皮肤疾病方面的研究[3-4]，有研究报道干细胞具有美容抗衰老的功效，其中干细胞分泌的各项细胞活性生长因子在修复受损细胞方面表现出很重要的作用；中国整形美容协会在2017年4月出台《干细胞抗衰老技术规范化指南》 对干细胞美容抗衰老工作提出一系列的要求和规范，促进干细胞美容医疗临床研究和应用的发展[5]。干细胞具有较高的端粒酶活性，是人体的青春活力因子；而冷冻干燥技术能有效防止细胞因子理化及生物特性的改变，对蛋白的分子结构和特征的损伤较小，通过真空干燥模式使其快速进入休眠状态，有效保护了有效成份的稳定性，如蛋白质、微生物类不会发生变性失活，易于氧化的物质得到保护，低温保存可长达2年，有利于开展其他各项试验研究[6]。