蓝藻是一种能产生光合作用的微生物，又称“光合蓝细菌”，一般是研究地球上光合作用和元素循环的重要模式生物。由于能够吸收阳光并利用二氧化碳进行放氧光合作用，蓝藻也被许多科学家视作一种具有广大应用前景的 “微生物细胞工厂”，并且通过对蓝藻合成生物学的不断研究，已经成功开发出了仅以CO2和水为原料的20多种燃料和化工产品的蓝藻合成途径。
然而相比大肠杆菌和酿酒酵母这两种目前普遍使用的合成生物学底盘微生物，蓝藻因其缺乏丰富高效的可用于从单个基因、代谢途径到全基因组水平的遗传操作工具，极大地限制了这种再生系统的基础生物学研究以及进一步开发和应用。但随着基因工具在调节基因表达、碳通量重新定向以及全基因组操作方面的重要性已在蓝藻合成生物学研究中得到越来越多的认可与关注，蓝藻相关的基因工具的研究在近些年来取得了许多重大进展和突破。而最近，天津大学的陈磊教授以启动子、核糖开关、核糖体结合位点、CRISPR / Cas系统、sRNA调控工具和基因组建模策略等方面综述了近些年来有关蓝藻基因工具的研究进展，本文对其内容进行简要介绍，供大家学习了解。
启动子（Promoters）
在对微生物进行基因编辑时，一般需要添加启动子元件来控制基因的表达。常用的启动子有组成型启动子和诱导型启动子两类。组成型启动子驱动基因在细胞中持续表达，不受时空及外界因素的影响，亦称之为非特异性表达启动子。诱导型启动子可以通过控制诱导物浓度来切换和调节特定基因的表达，通常都属于增强子，在光、温度、盐、激素等物理或化学信号作用下，使得目的基因的转录水平有所提高。
目前在蓝藻细胞里发现的一些内源组成型启动子如PcpcB、PpsbA2、PrnpB已被广泛使用在蓝藻的基因操作中，同时许多科学家也在致力于开发效率更高的组成型启动子，如通过各种蓝藻的大量RNA深度测序等生物信息学分析，成功找到Pcpc560和Prbc等强组成型启动子。而由于诱导型启动子的特异性，对适用于蓝藻的诱导型启动子也是许多科研工作者的研究重点。在早期研究种，由Lacl抑制和IPTG活化的Ptrc诱导型启动子被发现可以在Synechococcus 7942中高效控制基因的表达，但是该启动子在Synechocystis 6803中的效率却很低。而人工合成的L03启动子和其阻遏物tetR在Synechocystis 6803中有非常高的工作效率，且适用于其它许多藻种。下图1列举的是近年来在蓝藻基因操作中用到过的各种组成型和诱导型启动子。
图1.蓝藻基因操作中用过的各种组成型和诱导型启动子
核糖开关（Riboswitches）
核糖开关位于mRNA的非编码区（UTR）,它是一个顺时作用元件，通过与细胞自身产生的代谢小分子结合来调控基因的表达【图2是几种核糖开关的工作原理示意图：A）核糖开关促进基因翻译，具有核糖开关的靶mRNA的RBS将被隔离，但在用相关配体诱导后再次暴露；B）核糖开关抑制基因翻译，具有核糖开关的靶mRNA的RBS将在用相关配体诱导后被隔离；C）核糖开关促进基因转录，该转录的目标RNA将停止，但在用相关配体诱导后重新开始；D）外核糖开关抑制基因转录，靶RNA的转录将在用相关配体诱导后停止；E）基于核糖酶的核糖开关，具有基于核酶的核糖开关的靶RNA在用相关配体诱导后将自我切割】。
与诱导型启动子相比，核糖开关不需要额外的蛋白质因子，代表了更简单的基因调控工具，但目前很少有核糖开关可用作蓝藻的遗传工具。2013年首次将修饰的茶碱依赖性核糖开关引入蓝藻，实现了对Synechococcus 7942中蛋白质的严格调控。后续的研究中发现茶碱依赖性核糖开关也能在Leptolyngbya sp. strain BL0902、Anabaena sp. strain PCC 7120、Synechocystis sp. strain WHSyn 、Synechocystis 6803等蓝藻中起作用。
图2. 核糖开关工作原理示意图
RBS序列改造
核蛋白体结合位点（ribosome binding site, RBS）是原核生物mRNA上结合核糖体的一段序列，它独立于启动子并影响核糖体结合速率和翻译起始效率。对于合成生物学而言，RBS在多基因的协调表达和提高由多个外源基因控制的产物表达方面有重要作用。因此，在蓝藻的基因工程中，对RBS的序列改造的研究虽然不多，但也有一些成果。为了提高蓝藻合成2,3-丁二醇的最终产量，Oliver等人利用来自大肠杆菌的具有不同翻译效率的四个RBS序列来协调Synechococcus 7942细胞中alsS，alsD和adh三种基因的表达水平，通过筛选具有不同RBS组合的菌株文库，2,3-丁二醇的最终产量提高了1.8倍。
CRISPR / Cas系统
第三代基因编辑技术CRISPR / Cas系统作为现在生物学界最火热的明星，相信大家都不会陌生。CRISPR / Cas系统因其高效、精确的基因编辑效果，已被科学家们在动物、植物、微生物等许多生物细胞内进行基因编辑体系的建立，对于蓝藻也不例外。2016年，科学家们首次在Synechocystis 6803细胞内成功使用CRISPR / Cas9来干涉涉及糖原和聚羟基丁酸酯生物合成的关键基因以及对醛还原酶/脱氢酶的同时抑制。此外，科学家们又相继在Synechococcus 7942、Synechococcus 7002等蓝藻细胞内实现了CRISPR / Cas基因编辑体系的建立，证明了这种遗传工具在蓝藻中的应用。Synechococcus 2973的基因组序列与Synechococcus 7942的基因组序列非常相似，但Synechococcus 2973的倍增时间短至1.9 h，表明其生理学与Synechococcus 7942，并且可能是未来生产生物燃料和化学品的理想底盘。由于Cas9对Synechococcus 2973的毒性，Wendt等人在2016年利用温控质粒来控制Cas9的表达，实现了基因组编辑并扩展了这个有前景的快速生长底盘的工具箱。
图3所示， 三种Cas蛋白介导的CRISPR基因编辑工作原理示意图：A）Cas9介导的切割需要trRNA和crRNA或融合的sgRNA，导致靶DNA的平滑切割。B）Cpf1介导的切割需要单个crRNA，导致靶DNA的粘性切割。C）C2c2介导的切割也需要单个crRNA，导致靶mRNA的切割。
图3. 三种Cas蛋白介导的CRISPR基因编辑工作原理示意图
sRNA工具
sRNA因其参与各种细菌生物过程，如质粒控制、病毒复制和细菌毒力等，而受到生物学家们极大关注。更重要的是，基于内源性或合成性sRNAs的sRNA调控工具已经在合成生物学中显示了它们的优势，例如分别提高了8500倍的耐酸性以及成功实现在大肠杆菌中产生55％的1，5-戊二胺。
虽然数十种sRNA已经在蓝藻中得到了功能性阐明，但迄今为止，只有少数基于sRNA的遗传工具已经开发出来。2014年报道了Synechocystis 6803中sRNA工具的首次研究，其中具有顺式抑制序列的靶mRNA的翻译可以被反式激活RNA有效激活。此外，同样的研究人员通过利用来自MicF的sRNA支架和来自大肠杆菌的分子伴侣Hfq来逐步优化该系统以增强反式激活RNA的活性，以及增强顺式抑制序列的分子间杂交作用。作为成功的应用，上野等人在2017年使用该工具来调节AbrB样转录调节因子cyAbrB2以改善Synechocystis 6803中的糖原产生。
最近在Synechocystis 6803中开发了两种新的遗传工具，这两种基因工具是基于先前在大肠杆菌中开发的配对末端RNA（PTRNAs）以及外源性Hfq伴侣和MicC支架（Hfq-MicC）开发的【图4. 蓝细菌中PTRNA和Hfq-MicC工具的示意图：PTRNA包含由PT1和PT2组成的配对末端。通过选择来自靶基因翻译起始位点的反义片段设计PTRNA中的100bp结合序列；Hfq-MicC工具包含名为MicC的79bp脚手架，其可以被分子伴侣Hfq识别。MicC之前的24bp结合序列通过选择来自靶基因的翻译起始位点的反义片段来设计】。
图4. 蓝细菌中PTRNA和Hfq-MicC工具的示意图
结果表明，这两种调控工具在调控Synechocystis 6803的外源和内源基因方面运作良好，与野生型Synechocystis 6803相比，实现了基因表达的下调高达90％。此外，利用Hfq-MicC工具同时敲除多达4个与丙二酰辅酶A生成有关的基因，与野生型Synechocystis 6803相比，其导致细胞内丙二酰辅酶A丰度增加高达41％。
此外，sRNA可以有效改变耐受性。在这种情况下，非天然的sRNAs不能在蓝细菌中作为基因工具发挥功能，这是由于缺乏与大肠杆菌Hfq或保守的sRNA支架相似功能的伴侣蛋白。值得注意的是，在最近的几项研究中，计算预测、深度RNA测序和高分辨率微阵列已经评估了蓝细菌的非编码转录组，鉴定出蓝藻中与生物或非生物胁迫应答有关的各种sRNA。值得注意的是，在Synechocystis 6803中，sRNA CoaR已被证明参与辅酶A的生物合成调控，并且coaR的抑制增强了野生型Synechocystis 6803对1-丁醇的耐受性。图5总结了已知的与胁迫反应有关的各种蓝藻sRNA，可用于改善细胞对压力的耐受性。
图5.蓝藻细胞中的胁迫相关sRNA
基因组规模的建模策略
引入用于合成产物的异源途径可以改变整个细胞代谢，但是与大肠杆菌和枯草芽孢杆菌这样的异养生物相比，光合微生物的生物学特性尚未得到很好的理解。为了解决这些问题，基因组建模策略主要基于FBA或13 C通量分析可以为代谢转向提供有价值的见解和指导，以提高生产或对细胞中各种生理过程进行基础生物学研究。
由于蓝藻被认为是潜在的用于生物燃料或化学品生产的“光合细胞工厂”，一些研究通过在蓝藻中添加异源途径来进行基于约束的建模。例如Knoop和Steuer在2015年评估了Synechocystis 6803中乙醇、乙烯、乳酸、丙烷、丁醇、异戊二烯等合成的化学计量性质，为生物燃料合成提供代谢转换以及生长和产物之间的权衡策略。此外，Shabestary和Hudson 2016你年在Synechocystis 6803中使用了基因组模型预测发酵或反转的β-氧化衍生醇如1-丁醇的高生产力需要消除NADH吸收，而萜烯和脂肪酸需要打破细胞内ATP和NADPH的生产和消耗平衡。同样，Mohammadi 等在2016年基于Java开发了一种更加用户友好的计算工具，利用FBA公布了乙醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和丙醇在生物燃料生产中的产量增加。尽管如此，这些预测的可靠性仍然需要实验验证。值得注意的是，最近的两项研究利用基因组规模模型来提高柠檬烯和异丁醛的产量。Wang等人在2016年进行了柠檬烯通量响应光合输出的计算模拟，导致鉴定下游柠檬烯合酶作为关键代谢通量控制节点。有趣的是，通过逐步代谢工程，柠檬烯合成酶的提高比柠檬烯合成酶的轻微增加提高了100倍以上，表明合适的模型可以提供有用的指导。另外，Jazmin等人在2017年适用非平稳13C代谢流分析以比较野生型Synechococcus 7942和产生异丁醛的Synechococcus 7942工程菌株之间的途径通量。通量图揭示了丙酮酸激酶反应步骤的潜在瓶颈以及涉及三个相关旁路途径的酶，通过预测的关键基因的组合过表达提高了67％的产量。
蓝藻基因工具的未来方向
即使近年来关于基因工具的研究取得了很大进展，但由于大多数遗传工具尚未建立起规范，像适用于大肠杆菌的生物砖标准库就不适用于蓝藻。此外，生物学家进行FBA分析的困难限制了基因组规模分析的应用。为了解决这些问题，未来可能需要更多关注以下方面：
（1）应用高通量筛选方法开发遗传工具
与快速增长的微生物如大肠杆菌相比，蓝藻突变体的成功构建通常需要一个月或更长时间。因此，常见的试验和错误策略（即基于启动子或RBS文库的随机筛选）对于蓝藻是不实际的。高通量筛选方法对于加速建立蓝藻工具箱数据库是必要的。为实现这一目标，几种基于单细胞筛选的策略在未来可能会有用。2006年初，在Synechocystis 6803中开发了基于流式细胞术的聚-3-羟基丁酸酯的高通量筛选。最近，通过基于液滴的单细胞筛选开发了另一种用于鉴定基因工程产生的Synechocystis 6803的L-乳酸菌株的高通量方法。在这种方法中，来自UV诱导的文库的每个突变体被封装在液滴中，然后在液滴内产生L-乳酸并通过皮下注射器通过乳酸测定检测捕获的荧光。
（2）转录调节和自我切割介导的核糖开关的发展
发展转录调节核糖开关的一个重要动机是它们可以为蛋白编码基因和非编码RNA提供表达控制的可能性。通过将茶碱感应适体与间隔元件融合，然后与适配子互补序列融合，转录调节核糖开关已在大肠杆菌中表现出功能。类似地，蓝藻中的翻译调控茶碱感受核糖开关也可以被修改以在转录水平上起作用。此外，转录调控核糖开关可通过控制crRNA / tracrRNA或sgRNA等，与CRISPR / Cas系统等其他遗传工具配合使用。
（3）基于本地CRISPR / Cas系统的新基因组编辑工具的开发和优化
早在2013年，多达126个蓝藻基因组通过生物信息学分析内在的天然CRISPR / CAS系统，结果表明，除了海水蓝藻（Synechococcus 和Prochlorococcus），其中大部分都具有内源的CRISPR / Cas系统。虽然目前一些关于蓝藻CRISPR / Cas系统的研究主要集中在内源性CRISPR / Cas相关基因的功能阐明上，但这些结果将为基于天然蓝细菌CRISPR / Cas系统开发基因工具的可行性大大提高。
（4）转录调节和自我切割介导的核糖开关的发展
到目前为止，所有可用的sRNA调控工具都是在靶基因的敲低表达中起作用。尽管大多数细菌sRNA通过抑制靶mRNA而发挥功能，但先前也报道了可激活mRNA的sRNA，例如梭菌的VR-RNA和链球菌的FasX。同时，为了激活翻译，最近开发了RNA-IN / OUT系统，其中具有“IN”序列与靶mRNA结合形成隔离Shine Dalgarno序列的mRNA，但通过“OUT”序列释放该隔离结构。类似的遗传工具可以用于增强蓝藻中基因的表达。
（5）开发用于基因组模型分析的工具
FBA对代谢工程和基础研究来说都是一个非常有用的工具。然而，只有有限的研究在实验研究中应用了FBA。这个问题可能部分归因于当前模型的不完善，因为蓝藻基因组中许多未知和假设的基因仍未被阐明，以及缺乏一些实用的工具，如可编辑的在线工具，供研究人员执行基于约束的基因组比例模型分析。建立可轻松用于基因组模型分析并基于实验数据逐步优化的可编辑工具将显着促进蓝藻的应用和基础研究。
参考文献：Sun T, Li S, Song X, et al. Toolboxes for cyanobacteria: Recent advances and future direction[J]. Biotechnology Advances, 2018.
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