第一章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用一、微生物的基本培养技术1.研究和应用微生物的前提（即发酵工程的重要基础）：防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。（P9）2.在实验室培养微生物的要求：(1)为微生物提供合适的营养和环境条件(培养基）。(2)要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来（无菌技术）。（P9）（一）培养基的配制1．培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。（P9）2.培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。（P9）3．培养基的分类（按照物理性质分类）（P9）（1）液体培养基：不含凝固剂（如琼脂），呈液体状态。 用途：扩大培养获得大量菌种、常用于工业生产。（2）固体培养基：含凝固剂（如琼脂），呈固体状态。 用途：分离、计数、鉴定等。拓展了解：培养基的分类（按照化学成分分类）（1）天然培养基：含化学成分不明确的天然物质。用途：工业生产。（2）合成培养基：培养基成分明确。用途：分类、鉴定。培养基的分类（按照用途分类）（1）选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长。用途：培养、分离出特定微生物。（2）鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物。用途：鉴别不同种类微生物。4.怎样将液体培养基制成固体培养基？加入适量琼脂。（P9）5.实验室中最常用的培养基之一：琼脂固体培养基。（P9）6.微生物在琼脂固体培养基的表面或内部生长，可以形成菌落。（P9）7.培养基的基本成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。（P10）8.碳源:（1）概念：提供碳元素的物质。（2）分类: 无机碳源，如CO2、CO32-、HCO3-等。 有机氮源，如葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。（3）适用范围（一般情况下） 添加无机碳源培养基用来培养自养微生物； 添加有机碳源培养基用来培养异养微生物。9.氮源:（1）概念：提供氮元素的物质。（2）分类:无机氮源，如N2、NO3-、NH3、NH4＋等。 有机氮源，如牛肉膏、蛋白胨、尿素等。（3）适用范围（一般情况下） 不添加氮源培养基可用来培养固氮微生物。10.为什么培养基需要氮源？ 培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。11.含C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。12.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。13.能否根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型？ 可以，例如自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源。14.无机氮源能给自养型微生物提供能源吗？ 可以，例如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。15.无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，还能有什么功能？ 有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌） 有些无机盐离子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶）16.在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。17.是否所有培养基中都必须添加碳源、氮源？ 不是，例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利用空气中的氮气。（二）无菌技术1．获得纯净的微生物培养物的关键：防止杂菌污染。（P10）2.无菌技术应围绕如何避免杂菌的污染展开。（P10）3.无菌技术主要包括消毒和灭菌。（P10）4.无菌技术工作两个方面(1)对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。(2)对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（P10）5.做好消毒灭菌工作后，要注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。（P10）6.为避免周围环境中微生物的污染，应如何操作？ 在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。（P10）7.无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。8.消毒:(1)概念：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（P10）(2)方法:a.日常生活中经常用到煮沸消毒法，操作方法：100 ℃煮沸5～6min；b.对于一些不耐高温的液体如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s-1min；c.生物活体、水源等还可使用化学药物进行消毒，操作方法：用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等；d.接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射，操作方法：紫外线照射30min。（P11）9.灭菌:（1）概念：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（P10）（2）方法:a.培养基、培养皿等一般用湿热灭菌法，其中高压蒸汽灭菌的效果最好，操作方法：高压蒸汽灭菌锅内,100kPa，温度121℃,15～30min。b.耐高温的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿、金属用具等，可以用干热灭菌法，操作方法：物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h。c.接种过程中，微生物的接种工具、试管口、瓶口通过灼烧灭菌法来灭菌，操作方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。（P11）10.使用高压蒸汽灭菌锅时，能不能直接密封升温？ 不能，一定要将锅内冷空气彻底排出，才能密封升温，否则，可能引起锅内压力达到设定值而温度不能达到要求。11.高压蒸汽灭菌锅灭菌完毕后，可以立刻放气减压吗？ 不能，若立即放气减压瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢，甚至导致容器爆裂（须待灭菌锅内压力降至与大气压相等后才可打开排气阀开盖）。12.酒精消毒的最适范围是体积分数为70%-75%的酒精。 原因：酒精浓度过高时，菌体表面蛋白质变性过快，从而凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中，酒精浓度过低时，杀菌能力减弱。13.用紫外线进行消毒时，可以怎么做来加强消毒效果？ 照射前，适当喷洒酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。14.高压蒸汽灭菌使用的仪器为高压蒸汽灭菌锅，以水蒸气为介质，灭菌条件为压力200kPa、温度121℃、时间15-30min。15.干热灭菌法使用的仪器为干热灭菌箱，以热空气为介质，灭菌条件为温度160-170℃、时间2-3h。16.灼烧灭菌是将需灭菌的用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，优点是可以迅速彻底地灭菌。（三）微生物的纯培养1．纯培养概念：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。（P11）2.纯培养物概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。（P11）3.纯培养概念：获得纯培养物的过程。（P11）4.微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。（P11）5.微生物纯培养的原理：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。（P12）6.菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。（P12）7.一个单菌落即一个种群。8.菌落通常可以用来作为鉴定菌种的重要依据。9.获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法。（P12）10.培养基的灭菌方法高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）； 培养皿的灭菌方法干热灭菌（也可用湿热灭菌法）。11.倒平板时使培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。（P12）12.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？ 琼脂是一种多糖，在44℃以下凝固，倒平板时，若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。13.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？避免杂菌污染。14.拔掉瓶塞后为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。15.在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？不能。为什么？因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。16.倒平板时，能将培养皿的皿盖拿下来放在一边吗？不能。 应如何做？用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙。 为什么？防止杂菌污染培养基。17.刚倒完平板，可以直接倒置吗？不能，应等培养基冷却凝固。18.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 防止皿盖上冷凝的水珠落入培养基，造成污染（避免培养基水分过快蒸发）。19.怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？ 将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底(该操作也可确定培养基灭菌是否彻底）。20.未接种的培养基直接培养起什么作用？ 做空白对照，判断培养基是否被污染，判断培养基灭菌是否彻底；若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。21.若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？ 说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。22.划线工具接种环。23.连续划线的目的：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。24.平板划线法过程中，接种环蘸了1次菌液； 若分五个区划线，则接种环共需灼烧6次；25.灼烧后的接种环可以直接划线吗？不可以。 应如何操作？待接种环冷却后再划线。 为什么？避免温度过高杀死菌种。26.从第二次划线开始，都应从上一次划线的末端开始往下一区域划线。27.划线注意事项：（1）不要将最后一区的划线与第一区相连。（2）每次划线首尾不能相接。（3）每次划线前接种环进行灼烧灭菌。（4）最后一次划线结束也应该进行灼烧灭菌。28.整个操作中灼烧接种环的不同目的：取菌种前：杀死接种环上原有微生物，避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。每次划线前：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。接种结束后：及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。29.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？ 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落（课本：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经数次划线后培养，可以分离得到单菌落）。30.为什么划线时要注意不能划破培养基？（1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；（2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。31.培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板（一般做三组，目的：平行重复实验）和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48h。31.警示：（1）在实验室中，切不可饮食，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染；（2）使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。二、微生物的选择培养和计数（一）选择培养基1.寻找耐高温DNA聚合酶的思路是什么？根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2．水生栖热菌的筛选：水生栖热菌能在70～80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。（P16）3.从环境中获得某种特定种类的微生物的原理：某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，就可以从特定的环境中筛选得到特定种类的微生物。（1）在被石油污染的土壤中可以筛选石油分解微生物。（2）在冰川冻土层可以筛选耐寒微生物。（3）漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是生活污水吗？不是。4.实验室筛选微生物原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。5．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（P16）6.选择培养基三种筛选方法：（1）利用营养缺陷进行选择培养。 *营养缺陷的微生物不能正常生长（2）利用添加某种化学物质进行选择培养。 *添加杀伤性物质，有抗性的可以生长，无抗性的死亡（3）利用改变培养条件进行选择培养。 *调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长7.选择培养基实例（1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长。 原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用。 配制：使用加入青霉素的培养基。（2）目的：分离固氮菌。 原理：固氮微生物能利用空气中的氮气。 配制：使用不加氮源（以N2为氮源）的培养基。（3）目的：分离自养型微生物。 原理：自养型微生物能利用无机碳源。 配制：使用不加有机碳源（以CO2为碳源）的培养基。（4）目的：分离耐酸菌。 原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长。 配制：使用将pH调至酸性的培养基。8.选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或对其某一化学、物理因素的抗性不同而制备选择培养基。9.如何设计培养基筛选分解尿素的细菌？ 以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。10.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。11.在选择培养基上生长的一定是所选择的目的菌吗？ 不一定，有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证。12.怎么证明一个选择培养基具有选择性？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。（二）微生物的选择培养1.微生物的选择培养方法：稀释涂布平板法。（P17）2.稀释涂布平板法基础操作：梯度稀释和涂布平板。3.稀释涂布平板法方法概述：由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。（P17）4.平板划线法的作用：分离纯化微生物。 稀释涂布平板法的作用：分离纯化微生物、统计样品中活菌的数目。5.分离纯化微生物具体含义： 将单个微生物分散在固体培养基上，经培养得到单菌落（即纯培养物）。（P18）6.③号试管稀释倍数为104。
7．分解尿素的细菌的分离：分解尿素的细菌能合成脲酶，该酶能催化尿素分解产生NH3，以此作为细菌生长的氮源。要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方设计思路是培养基中除含有细菌必需的碳源、水、无机盐外，只含有尿素一种氮源。8．稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌操作过程如下：采集土样→将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面（多了不易被吸收）→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温箱中培养1～2 d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。（P17）（三）微生物的数量测定1.微生物的数量测定方法：间接计数法——稀释涂布平板法、直接计数法——显微镜直接计数法。（P18）2．稀释涂布平板法原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（P18）3.样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。（P18）4.稀释涂布平板法的计数原则：（1）选择菌落数为30-300的平板计数；（2）同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。（P18）5.稀释涂布平板法结果分析：（1）统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。（2）统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。（P18）6.C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；M代表稀释倍数；则每g样品中的细菌数=（C÷V）×M。7.将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。8.恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。9．显微镜直接计数法原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。10.显微直接计数法使用的计数工具： 血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等计数； 细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。11.显微直接计数法优点：快速直观。12.显微直接计数法缺点：（1）统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。原因：不能区分死菌与活菌。（2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。（P18）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。（P18）2.实验步骤：土壤取样→制备培养基→样品的稀释与涂布平板→微生物的培养与观察。（P19）3.土壤取样：（1）取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。 （P19） 原因：细菌适宜在该环境中生长。（2）取样过程：取样时一般要铲去表层土。 原因：细菌绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。（3）注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。4.制备培养基:（1）作对照：牛肉膏蛋白胨培养基。 （P19） 作用：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。（2）实验组：选择培养基。 特点：以尿素为唯一氮源。 KH2PO4和Na2HPO4的作用：提供无机盐、调节pH。 尿素作用：氮源。 葡萄糖作用：碳源。5.样品的稀释与涂布平板:（P19）
（1）每个浓度至少设置4个平板。 1.2.3平板是实验组，为选择培养基，做3组的目的平行重复。 4是对照组，为牛肉膏蛋白胨培养基。（2）整个实验还需要设置2个平板，是哪两个？ 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 目的：用来判断培养基中是否含有杂菌（培养基灭菌是否合格）。（3）为获得菌落数在30-300之间适于计数的平板，测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。（4）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样才能保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养（例如可以将1×103-1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养）。（5）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记，例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。（6）标记时注意标记在皿底，不能标记在皿盖。6.微生物的培养与观察（1）培养条件：细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。（2）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（3）为什么选取菌落数目稳定时的记录作为结果？ 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。（4）一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。7.结果分析（1）说出下列各组培养基的目的： 3组接种的选择培养基：对土壤中分解尿素的细菌分离和计。 1组接种的牛肉膏蛋白胨培养基：判断选择培养基是否具有选择作用。 不接种的选择培养基：验证选择培养基中是否含有杂菌。 不接种的牛肉膏蛋白胨培养基：验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。（2）说出以下现象对应的结果分析：现象分析
未涂布培养基上无菌落生长培养基未被杂菌污染
未涂布培养基上有菌落生长培养基被杂菌污染
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目选择培养基具有选择作用
（3）样品稀释操作成功的标志是什么？得到2个或2个以上菌落数在30-300的平板。（4）得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定。拓展——分解尿素细菌的进一步鉴定1.原理:细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌；2.方法: 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。 *液体培养基可以直接看液体的变色情况； *固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带； *红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
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