中国农业科学院饲料研究所
水产动物营养与饲料研究室
周志刚 研究员
近年来，通过产业结构调整，我国水产养殖业得到长足的发展，已经成为举足轻重的产业。目前，我国海洋捕捞总产量为1700万吨。由于渔业供给侧改革，到2020年，我国海洋捕捞总产量将减少到1000万吨以内，因为限补减少的水产品供应量会达到700万吨。此外，水库和湖泊的限养会导致200万吨的缺口，消费水平的提升又会增加120万吨的机遇缺口。因此，为了满足消费需求，水产养殖面临着一个1020万吨的市场缺口，占现有养殖总量的20%左右，这是水产养殖的一个巨大的市场机遇。
一、我国水产养殖面临的挑战
水产养殖面积越来越少，为了满足产量需求，我国水产养殖的现状是高密度、多品种、集约化的生产方式。高密度饲养导致鱼虾的排泄物增加，饲料成分改变，并加剧了各类应激和病菌病、病毒病、寄生虫病的发生。养殖单位、养殖户为了减少损失，加大饲料中抗生素和化学药剂的用量，甚至使用一些低价高残留药物。虽然有效控制了各种水生动物病害的爆发，但是也同时导致药物残留、耐药性、食品安全及水环境污染的问题发生，无抗高效水产养殖方法日益受到重视。
二、升级水产养殖抗生素减量使用思路
无抗高效水产养殖支撑体系要求水产养殖过程无抗、高效、简单，因此，我们在养殖策略上必须与过去有所区别。对于内消化道菌群的调控，我们已经熟悉并接受。养殖环境是动物内消化道的延伸，相当于动物的外消化道。因此，我们策略是把内外消化道的菌群调控结合在一起，在经典益生菌的基础上，开发新的益生元件和土著益生菌，实现养殖全程无忧，包括培育无抗无忧的种苗，无忧养成，以及向市场输送相对比较安全的水产品。
三、消化道菌群调控实现抗生素替代
动物养殖中使用的抗生素包括促生长用抗生素和药用抗生素。寻找抗生素替代产品，我们需要回归到抗生素本身的作用及其作用机制上来。
（一）促生长用抗生素（喹乙醇）替代策略
1.喹乙醇促进鱼体生长，降低鱼体抗病力
喹乙醇是目前饲料工业中最常用和用量最大的药物类饲料添加剂，在水产饲料中应用相当广泛。喹乙醇促生长的效果很明显，但副作用是损伤了抗病力。150mg/kg喹乙醇实现鱼体促生长12%，但导致鱼体抗病力下降60%。
2.喹乙醇改变肠道菌群丰度与结构
抗生素的使用肯定会导致肠道菌群变化。喹乙醇改变了肠道菌群结构，厌氧菌的相对丰度升高，肠道菌群丰度降低50%。
3. 喹乙醇促进鱼体生长是间接作用
借助一个无菌鱼系统，证实喹乙醇的作用是直接作用还是间接作用。结果发现，喹乙醇自身并不直接影响鱼体的标准代谢和存活率，而是通过改变肠道菌群的介导来实现的。因此，我们可以直接从消化道菌群调控入手来实现鱼虾促生长，摆脱抗生素的使用。
4. 肠道菌群调控是深进抗生素替代研发的核心
菌群是否具备代替抗生素的能力，直接调控菌群能否实现抗病或促生长的效能？据文献报道，精油的促免疫作用是直接作用和间接作用的综合结果，正向效应完全取决于肠道菌群介导；外源核苷酸添加导致的鱼体标准代谢降低完全是由肠道菌群介导的，核苷酸引起的肠道菌群改变导致了鱼的标准代谢能力下降，实现了25%促生长的效益。因此，肠道菌群可以作为鱼的免疫抗病和营养代谢的靶标。这个结果对我们来说也是非常有启发意义，它说明肠道菌群是我们深进在水产动物里面抗生素研发替代的核心和源头。
（二）药用抗生素替代策略——益生菌的作用机制
药用抗生素在水产养殖中的应用，主要是预防和治疗细菌病、寄生虫病和病毒病等。传统的策略是杀菌、驱虫以及提高鱼虾非特异性免疫力。目前我们希望通过消化道菌群的介导实现创新性的策略，对细菌病由过去的杀菌变成不杀菌，对寄生虫由过去的驱虫变成杀虫，对病毒病由过去的提高非特异性免疫力变成杀病毒，充分发挥消化道菌群的调控作用。
1. 肠道粘附是鱼类饲用乳杆菌抗感染的前提
目前，在水产养殖领域的很多研究均借鉴于畜禽或人类领域，但是由于水产动物自身的特异性免疫力比较弱，所以会表现出很多跟畜禽不一样的趋势和结果。
1）体外抑菌力强不代表抗病力强
经典的益生菌，无论是乳酸菌还是酵母菌，在筛选的时候都会把抑菌作用放在一个很重要的前提上，首先看的就是益菌圈。然而，对于鱼类而言，肠道粘附才是其抗感染的前提。例如，在本身抑菌能力一样的前提下，强粘附的短乳杆菌JCM 1170和弱粘附的嗜酸乳杆菌JCM 1132对罗非鱼的抗病力不同，JCM 1170的抗病力远远高于JCM 1132；在本身抑菌能力强粘附植物乳杆菌JCM 1149抗病力＜弱粘附嗜酸乳杆菌JCM 1132的前提下，JCM 1149对斑马鱼的抗病力大于JCM 1132。所以，在抗病力方面，鱼类肠道粘附性比益生菌本身的抑菌能力更重要。
2）不同乳杆菌的肠道粘附类型不同
鱼类的黏液层相对畜禽来说要薄很多，只有畜禽的1/10。所以，水产动物肠道粘附是一个需要更细化的概念。在张和平老师的协助之下，我们获得了很多乳酸菌资源。研究发现，不同的乳酸杆菌在鱼的消化道上的粘附分布区域不同。对于斑马鱼消化道，乳杆菌分为混合粘附型（黏膜及黏液均匀分布）、黏膜粘附型（75%及以上粘附在黏膜上）或黏液型（75%及以上粘附在黏液中）。鱼类消化道混合粘附型乳杆菌的抗病力显著高于黏膜粘附型。也就是说，今后在水产养殖中使用益生菌时，应选择混合粘附类型，既能在黏液里面粘附，也在黏膜上也能粘附。
3）黏膜粘附型乳杆菌可致损鱼类肠道健康
鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GG是属于黏膜类型的乳杆菌，研究发现它可以介导菌毛蛋白SpaCBA，致损鱼类肠道黏膜。但是，如果我们把它的跟粘附相关的基因消除，它就可以变成一个混合粘附类型，在粘附数量并不发生改变的情况下它的抗病力明显增强。
4）黏液粘附型乳杆菌停喂后会诱发鱼类抗病力崩溃
在水产中，应避免使用单纯的黏液粘附类型的乳杆菌，因为它的排空率太高。我们在是一个很明显的一个案例。使用植物乳杆菌和短乳杆菌连续饲喂罗非鱼，发现鱼的抗病力明显提升，并且植物乳杆菌的提升能力显著高于短乳杆菌。但是，在水产动物养殖过程中，由于天气和人为操作等很多方面的原因，我们可能不会做到连续投喂益生菌。我们可能很少去关注益生菌一旦停喂之后，鱼的抗病力会发生什么变化。从实验室模拟试验的结果来看，停喂益生菌三天之后，对鱼进行攻毒，结果发现喂过植物乳杆菌的鱼在停用后抗病力甚至不如对照组。因为，黏液粘附型乳杆菌在停喂之后会迅速流失，诱发鱼的抗病力的崩溃。这个结果首次明确了传统益生菌在我们鱼虾里面的停喂风险，告诉我们一旦使用经典乳酸菌饲喂鱼虾，不要冒然停用。如果在水塘里面或鱼池里面出现病菌爆发，你喂过的鱼可能会死得更多。
四、益生元件的开发与利用
（一）鱼类消化道微生物益生元件比传统益生菌存在应用优势
我们做了大量水产养殖里面不同的鱼虾的消化菌群的特点比较，结果发现，鱼类消化道菌群存在巨大个体差异、种间差异与节律变化，并受制于多变的栖息生境及饵料来源，无论是菌群多样性、丰度还是稳定性均远不及哺乳类消化道微生态。
传统的乳酸菌和酵母菌等益生菌并非鱼类消化道土著优势菌群，在鱼类消化道菌群调控上暴露出问题和风险。鱼类消化道菌群调控虽然可以摈弃传统益生菌的思路，改从鱼类消化道土著优势菌着手，但这些优势菌以厌氧的G-菌为主，产业开发及应用上受到限制。因此，在水产养殖中，我们需要去挖掘一些属于水产动物自身的或者土著的益生菌。
（二）开发益生元件的技术手段
一方面可以通过基因工程的方法将其有害效应元件去除，如鼠李糖乳杆菌L. rhamnosus GG菌毛蛋白SpaCBA缺失株对斑马鱼抗感染保护率比野生株提高超过1.8倍（Scientific Reports，2017）；另一方面可以通过生物工程或生物化工的方法将传统益生菌和鱼类消化道土著菌（包括通常被视作潜在病原菌的种属）的益生元件放大加以应用。
（三）鱼类消化道菌群代谢性酶蛋白的开发
1. N-酰化高丝氨酸内酯酶
N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)的金属蛋白水解酶，广泛存在于多种微生物中。群体感应淬灭策略（Quorum quenching, QQ）是一种新型的抗菌策略，其本质是通过破坏病源菌的群体感应系统，使其无法正常表达毒力基因而失去了致病能力，变成无毒菌株。研究证明N-酰基高丝氨酸内酯酶作为一种新型抗菌策略（QQ）的工具酶具有巨大的应用潜力和广阔的应用前景。
我们获得了一种适于水产养殖环境应用的N-酰基高丝氨酸内酯酶 AI- 96，该淬灭酶具有耐高温、高比活及枯草芽孢中分泌表达的性能，具有防治鱼类养殖革兰氏阴性细菌性病害的功能。AI- 96可以显著降低了肠道病原菌 NJ- 1 的丰度，有效地降低由病原菌 NJ- 1感染斑马鱼引起的死亡率，但却未表现显著免疫保护率。
斑马鱼各处理组浸浴攻毒累积死亡率
2. 几丁质酶
粘孢子虫的寄生引起的粘孢子虫病给水产养殖业造成了巨大的经济损失。但由于粘孢子虫的成熟孢子外有一层几丁质壳瓣，具有强耐药力，至今也未筛选出一种低廉、安全、效应快的药物，使粘孢子虫病的防治成为一个难题。孢子虫的外部有非常厚实的几丁质壳瓣。生物信息学分析表明，胞子虫基因组自身并不编码任何与几丁质降解相关的基因，所以通过外源消化道微生物途径降解胞子虫，有可能实现对它的防治。通过几丁质酶筛选培养基和以粘孢子虫为唯一碳源的培养基，获得一株几丁质酶活最高的菌株Aeromonas veroniistrain CD3，并获得了几丁质酶的编码基因，用该基因在大肠杆菌中表达的几丁质酶对粘孢子虫孢子处理，进行光镜检测，试验结果显示，几丁质酶ChiCD3可显著降解孢子虫的几丁质壳瓣（共浴破壁率>35%），可以有效防治寄生虫病及促进生长。
（四）鱼类消化道菌群结构性酶蛋白的开发
鞭毛作为细菌的运动器官,也是重要的毒力决定因子, 在细菌粘附、生物被膜形成以及几种病原菌定植中同样起关键作用，并参与了一系列的致病过程。鞭毛蛋白作为细菌鞭毛的重要组分,在病原菌的致病过程中往往发挥重要的作用。鞭毛蛋白作为细菌重要的毒力因子，能有效激活天然免疫应答。研究发现，细菌鞭毛蛋白可以显著降低鱼类粪便病毒载量，降低腹泻率。因此，通过开发鱼类消化道菌群结构性蛋白支撑菌群本身的防控，是一个非常有前景的研究方向和应用方向。
五、消化道调控实现全球水产养殖无抗无忧计划
（一）内消化道调控
通过消化道微生物本身以及使用益生元件来调控内消化道，我们有望协助很多企业实现一些功能饲料配方的调整，对病毒病、细菌病、寄生虫病和生长应激等实现有效的治疗和预防，最终实现水产养殖的生长无忧、应激无忧和美味无忧。
（二）外消化道调控
从水产养殖的自身环境里面找到原位的益生菌实现对水体中鱼虾排泄物的消除。我们将土著益生菌直接泼到水体中或通过无忧伴侣饲料，对水体中的氮或硫等对鱼虾有害的元素进行分解、转化和释放，改善水体质量，是一种有效、长效和廉价的替抗方案。
六、结语
禁抗已成大趋势，我们立足于促生长用抗生素替代及药用抗生素减量使用，针对传统抗生素替代品益生菌饲用改善不稳定问题，重点开发了防病和促生长用水产动物消化道微生物益生元件，并实现了淬灭酶（防治细菌病）和几丁质降解酶（防治寄生虫病及促进生长）的产业化生产。通过消化道内外菌群调控，有效解决了我国水产养殖中细菌和寄生虫病害防治的问题，对促进水产健康养殖，提高首都水产品的安全卫生质量，以及在水产养殖业环境保护和保障人民健康方面具有重要意义。
BFC·第五届中国生物饲料科技大会在累累硕果中圆满落下帷幕，开创了行业学术会议务实创新的新模式，大会为全国畜牧饲料界广大同仁提供了高效高端高质的交流平台，为我国生物饲料科技进步和产业化推波助澜。每年九月第二个周末，我们不见不散！
本文内容根据周志刚研究员在BFC·第五届中国生物饲料科技大会上的报告整理而成，未经本人审阅。
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文/刘晶晶 博士 编/马维军
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