抗RAS突变癌症的“前世与今生”

近日，Nature杂志发表了一篇题为“Small molecule combats cancer-causing KRAS protein at last.”(图1)的文章。

△图1、Small molecule combats cancer-causing KRAS protein at last

打开文章首先能看到的就是“不可成药（Undruggable）”和“第一个在临床表现出抗癌活性的同类药物（The inhibitor is one of the first of its kind to show anticancer activity in the clinic）”。再次搜索则是铺天盖地的关于安进AMG-510的消息（详情请点击：没有“不可能”！——安进率先攻破“不可成药蛋白”，发布首个KRAS抑制剂AGM510临床试验数据）。

在追遍关于“RAS”的前世今生及其研究进展并成文后，本文作者对该方向进行了回顾性综述。希望对行走在抗“RAS”癌变路上以及对将要入门的同仁有所帮助。

“Undruggable”的RAS

RAS基因家族包括KRAS、NRAS 和 HRAS，1982年，Weinberg等人在人类膀胱癌细胞（T24/EJ）中发现了突变激活的RAS基因—HRAS，此次发现的基因突变是继20世纪60年代Harvey和Kirsten等人发现老鼠肿瘤基因HRAS和KRAS后，首次发现的人的突变基因。随着对癌症基因组的测序研究的深入，人们发现RAS与癌症关系密切，是最常见的致癌基因。在COSMIC数据库中仅除神经系统和腹膜、肝脏、食道等几项肿瘤中没有见到RAS家族的身影外，其他几十种癌症中全部包含RAS突变，而KRAS突变是最常见的基因突变。占RAS突变的85%，该突变在胰腺癌中占比最高，达到了54%（图2），其次为结肠癌和女性生殖道肿瘤，分别为32%和25%，肺癌为15%。最近的一项研究发现，KRAS通过RNA剪接表达的称为KRAS4B的蛋白能够间接的抑制Wnt通路，而致使某些细胞具有干细胞特性，而其他两种亚型则不具备这种功能，这可能也是KRAS在人类肿瘤中具有更高突变概率的原因，从癌症的进化角度来说突变更利于癌症的发生，也正因为这种原因大多数关于RAS的生物学研究以及抗肿瘤药物均以KRAS突变展开。

△图2、最常见的前20个致癌基因

RAS蛋白为什么会被冠以“Undruggable”的名号，这个就需要从它的结构、原理和功能说起 。RAS基因编码的RAS蛋白是一种21kDa大小，具有与鸟苷三磷酸（GTP）/鸟苷二磷酸 （GDP）结合活性的膜蛋白，位于细胞膜内侧。其作用相当于分子开关，正常情况下与GDP结合时处于非活化状态，当接收到刺激信号后，RAS蛋白与细胞内的GTP结合，调节其下游信号通路中的效应蛋白进入活性状态，从而参与跨膜信号的传递过程。在膜相关的酪氨酸激酶和核苷酸交换因子的作用下，GTP被迅速水解成GDP，RAS重新与GDP结合使信号处于非活化的的状态。

RAS处于各种信号通路的中枢位置，下游控制的通路包括Raf、PI3K和RalGDS等；RAS在分子水平上可以调控蛋白质的合成，基因转录等过程；细胞水平上影响细胞形状、生长、分化、凋亡等。RAS既可以在这些肿瘤基因的下游传递放大信号，也可以反馈增强它们的致癌功能。RAS作为原癌基因，一旦被激活就成为致癌基因。最常见的激活方式是基因的错义突变，基因突变导致RAS蛋白空间结构的改变，使RAS持续保持与GTP结合的活化状态，不断激活其下游的信号通路。除RAS的持续活化状态，也有pRb和p53的功能缺失是致癌的另外两个主要因素，他们是目前已知的肿瘤基因突变最多的三个基因。pRb和p53是肿瘤抑制基因，导致癌症的因素往往是蛋白缺失或功能异常，很难找到药物直接干预，因此RAS成为了众矢之的。

RAS蛋白是由188或189个氨基酸组成，它的第一个结构域含有166个氨基酸，该结构域在各个亚型中高度保守。RAS蛋白氨基酸氨基酸序列差异主要位于C末端，该结构域则高度可变，结构生物学揭示RAS蛋白表面类似一个光滑的圆球，缺少药物结合的靶向“凹陷”和“裂缝”。这就是RAS被冠以“Undruggable”的最主要原因。

直接or间接抑制？

RAS基因作为重要的癌症基因，自发现以来已经过了30多年研究。尤其是KRAS基因在人类癌症中的高突变率及其在肿瘤发展中所发挥的重要推动作用，使其成为肿瘤分子靶向治疗的理想靶点之一。目前，靶向治疗RAS的主要方向有以下几个：第一，直接抑制RAS；第二，干扰RAS与下游效应分子的结合和阻断下游信号通路。第三，阻断RAS蛋白在细胞膜上的定位，第四，合成致死方式与RAS基因相互作用。

相比于上下游抑制的间接方式，研究人员似乎喜欢直接抑制。首先研究人员从ATP竞争型激酶抑制剂的成功研发中得到提示，试图找到能与GTP竞争结合RAS的化合物。但由于GTP与RAS在及其微量的情况下有超高的亲和性，使得竞争性抑制剂的研发变得异常困难。正如上文中提到的RAS与GTP的结合、激活是由膜相关的络氨酸激酶和核苷酸交换因子等共同作用的。因此，研究者们试图抑制RAS-GTP的核苷酸交换而阻止细胞的癌变，1997年，Taveras[1] 等人通过计算机模拟的方法筛选了多种化合物与GTP竞争RAS的核苷酸结合位点，这些化合物虽然能够抑制RAS突变细胞的生长，但均含有羟胺，而羟胺的代谢稳定性差且毒性强，最终导致该系列化合物不能成为理想的候选药物。此外，也曾有研究人员试图阻断RAS与GTP酶激活蛋白的相互作用而抑制RAS的活化，但由于其缺乏特异性的靶向作用，导致正常RAS蛋白功能异常，对机体会产生较强的毒副作用。

为了能特异性地抑制突变RAS蛋白的功能，研究者们也在不断寻找活化的RAS和非活化的RAS蛋白之间的结构差异来研发新型小分子药物。2013年,Ostrem[2]等人，首次报道了一类小分子化合物，该化合物能不可逆的与非小细胞肺癌中最常见的KRASG12C突变体的12位突变后的半肤氨酸残基形成共价结合。结构生物学发现，在该突变体中存在一个“小空穴”，这是在RAS蛋白结构中从未见到的空穴，这类小分子化合物能够稳定的结合在该空穴处，从而改变KRASG12C的亲和性，使其对GDP更具亲和力，达到抑制KRAS[3]活性的效果。这一靶点的发现在抗KRAS突变过程中具有“里程碑”的意义，为KRAS靶向抑制剂的开发工作提供了新的思路。其后，多个研究小组分别以KRASG12C为靶点和成了GDP类似物。包括靶向12、13、61位密码子突变位点的化合物。最近，安进公司公布的AMG-510就是以KRASG12C为靶点的直接抑制药物，尽管到目前为止，对KRAS直接靶向的作用的尝试已经显示出有一定的效果，但进入临床仍然有很长的路要走，例如如何提高药物与靶点的结合力或亲和力，再如RAS中是否还存在其他更理想的结合位点，以及不同结合位点的作用机制等。

研究人员在研究直接抑制的作用的同时也在尝试切断RAS与GTP下游效应分子结合，干扰细胞生长信号传递促使细胞凋亡,达到癌症治疗的效果。研究人员发现，GTP与RAS的结合物存在着至少两种不同的构象，并且不同构象之间的相互转换速度以毫秒为单位。目前对这些不同构象与RAS蛋白生理学功能之间的联系仍然存在诸多争议，虽然经证实其中某个构象之间存在一定的“凹陷”可以作为药物的靶点，但大多数该类化合物均属于有机金属难以成药，且亲和力较低也是需要解决的问题。另一个可阻断RSA-GTP与下游效应分子结合的方式是直接靶向结合下游效应分子，间接阻止效应分子与RAS-GTP的结合。由此，不同的研究人员设计过不同的抗体类药物和多肽类小分子抑制剂。1998年，Darlene[4]  等人曾经设计出一种只有7种氨基酸的小分子化合物抑制RAS-GTP与RAF结合的抑制剂，按照文献报道上所说，其筛选的21种多肽抑制剂中，仅有1种体外实验表现尚可，但由于其效果和亲和力差也未能得到进一步开发。关于此种抑制剂目前多数还处于机制研发或实验室研发阶段，能否进入临床仍有待进一步研究。

RAS下游信号通路抑制剂

由于直接靶向下游分子结合的难度较大，人们开始尝试开发RAS下游信号通路为靶点的抑制剂，这一类抑制剂似乎成为抑制RAS突变的突破口，现已经是RAS突变癌症治疗的最有前景的药物。被人们研究最深入最广泛的两条下游通路分别是RAF/MAPK、PI3K/AKT/mTOR。从该类抑制药物整体研究进展和临床数据来看，单一靶点抑制效果并不好。原因是抑制一条通路激活后，往往会造成旁路的过度激活。虽然这两条通路抑制剂在临床上没有取得卓越的成效，但也不能否认这两条通路抑制剂在RAS突变肿瘤中的意义。例如：FDA已经批准上市的Vemurafenib、selumetinib、Trarnetinib。其中Vemurafenib曾在被美国临床肿瘤学会评选为2011年临床肿瘤5项重大进展之一，但主要作用并不在RAS突变肿瘤中，而是用于BRAF突变的黑色素瘤。RAS下游的另一条被广泛研究的通路是PI3K/AKT/mTOR，目前至少98项临床试验针对PI3K激酶信号通路抑制剂，66项针对ATK激酶信号通路抑制剂，其中包括多个已经上市的多种药物，例如：贝伐埃罗替尼和吉非替尼、派姆单抗、曲米替尼等。

RAS蛋白在细胞膜上发挥其生物学活性作用，需要细胞质中合成前体蛋白后经历一系列的修饰过程，这一系列蛋白翻译后的修饰过程需要一系列的酶的催化作用（如图3）。由于其整个酶催化机制较复杂，且与此文相关性较小，因此不再赘述，研究人员在上世纪90年代初期着手努力研发相关酶的抑制剂来靶向RAS突变疾病的治疗。其中最值得一提的是2007年Lee等人[5]在牛樟芝中萃取出的一种天然小分子化合物—安卓奎诺尔(商品名：安卓健)，现已全球范围内上市，其适应症包括非小细胞肺癌、肝细胞癌、乳腺癌等多种RAS突变导致的癌症。另一个值得一提的是 Concordia公司研发的一款用于胰腺癌的小分子酶抑制剂（Salirasib）现在处于II期临床实验阶段。

△图3、RAS蛋白生物学活性的酶催化作用机制

合成致死方式与RAS基因相互作用

许多抑制RAS突变的药物在杀死肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成不可逆的毒副作用。这种毒副作用限制了其在临床上的应用。正常细胞要变为基因组不稳定、无限增殖和抗凋亡等十大标志的肿瘤细胞，在变化的过程需要许多表观或遗传学的改变以及微环境的变化[6]。细胞的这些表观遗传学的改变主要由于特定基因的变化，而这些特定的基因就可以作为肿瘤特异性治疗的理想靶点。然而。单一特异性基因抑制不会对癌细胞造成死亡，需要筛选能够协同作用的另一个基因，两个基因同时被抑制才能特异性的杀死癌细胞而不损伤正常细胞，这就是合成致死或协同致死的基本原理。首款上市利用协同致死抗癌的药物于2014年12月FDA批准的，其原理是PARP抑制剂与BRCA1/2突变之间存在合成致死作用。

部分RAS突变基因的协同致死基因的筛选结果

总结和展望

经过多年的努力及技术的革新，虽然科学家门筛选出的一系列的基因、酶类和化合物[7]，也不断有新的靶点和协同致死“药物”被发现，但进入临床仍需要大量的更加深入研究去验证。

尽管效应抑制似乎是目前最有前途的RAS靶向策略，但仍存在相当大的挑战。首先，一种效应通路的抑制都存在复杂的代偿机制，需要多点抑制。其次，多个效应分子具有驱动作用，需要同时抑制多个通路。然而，正如前文中所述的那样，同时多点或抑制多个通路可能打破正常细胞的生理状态，引起机体毒性。多种“抑制剂”连用或合用将是其在成药前首要考虑的问题。

治疗RAS突变之路困难重重，但三十多年来一直是肿瘤学和治疗领域研究的热点，未来将会有更多的创新性“药物”和治疗手段不断被开发出来，相信经过不懈努力，RAS这个“无人高地”必将被攻陷。