抗体溶液外观变色的机理和解决策略探讨

抗体溶液的外观在产品放行检测时是一个重要的质量参数。如果某一批抗体在储存过程中外观颜色的变化意味着产品可能被污染、有杂质或降解产物，这进一步反应可能是这批生产过程中出现了问题。生产批次作废导致的经济损失是一方面，另外一个可能碰到的问题是临床试验过程中，抗体产品颜色变化导致和安慰剂的颜色不一样，不再是双盲。本文简单探讨一下这种外观变色的机理和解决策略。

抗体DS（原液）变色的第一次报道大约在十年前，也就是化学成分限定的培养基（以下简称CD培养基）开始应用于生产以减少批次间差异的时候，也是高浓度皮下注射抗体制剂开始开发的时候。化学成分限定的培养基成分非常多，有些多达上百种化合物，这些化合物和抗体药物相互作用的机理还不是很清楚。下面我们先讨论上游细胞培养工艺对抗体溶液颜色的影响。

图一 左：黄色的抗体DS，右：抗体DS在近紫外-可见光照射后的颜色变化

铁离子在CHO细胞的生长和蛋白表达中起到很重要的作用，有研究表明提高铁离子浓度会显著提高蛋白质的产量。然而，Vijayasankaran研究组第一次发现当CD培养基的铁离子浓度达到75mM时会对产品的质量产生影响，例如加深了产品颜色（如下图1左）和酸性峰。需要注意的是，铁离子并不是直接影响产品的颜色，一般经过下游纯化后仅有非常低的铁离子会进入最终产品。

一种假设是铁离子通过提高ROS（活性氧）催化了抗体产品的氧化反应。这种假设的机理在后来的实验中被证实。研究通过LC/MS发现高铁培养基表达纯化的抗体中的暴露于蛋白表面的两个Trp（色氨酸）在近紫外-可见光条件下（如图一右）会逐渐被氧化形成NFK（N-formylkynurenine）和Kyn（kynurenine），这两种化合物都是显黄色，4天的黄色主要由NFK和OH-Trp造成，14天的深颜色主要归咎于Kyn。具体反应机理如下图二：

图二色氨酸的氧化路径

维生素B12是另一种常见的会导致最终抗体溶液产生异常颜色的培养基成分。B12在CHO细胞生长过程中是必需的，在碳单元转移和DNA合成中扮演辅酶作用。B12有四种异构体（cyano-、hydroxo-、adenosyl-、methyl-cobalamin），这四种在水溶液中都是深红色。Prentice等第一次报道了B12导致抗体溶液变成粉色的外观，他们的研究发现是B12的其中一种异构体hydroxo-B12可以和抗体发生结合，且不能在下游纯化工艺中去除。但是奇怪的是，在该培养基中使用的是cyano-B12，一种推测是光照使得cyano-B12转换为hydroxo-B12，该推测在小规模实验中得到证实。关于B12和抗体结合的机理，在另一个报道中发现hydroxo-B12的Co离子和抗体的Cys（半胱氨酸）形成了共价键。二硫键的还原可产生多个游离的巯基，因此有可能会有多个B12结合到抗体上，这种情况下培养基的B12浓度和最终的抗体原液的红色或粉色会成比例关系。除了维生素B12外，B2对糖、氨基酸和脂类代谢很重要，也是培养基常见成分。B2的溶液也呈现黄色，在很多缩小工艺的模型中也会进入最终的抗体DS中。

图三左：粉色的抗体DS，右：黄色的抗体DS和粉色的维生素B12溶液混合产生棕色

一个比较有意思的案例是生产工艺中抗体的DS呈现了棕色。在LC/MS研究中，发现了NFK、Kyn两种修饰。另外，经过多种颜色对比研究，最终发现黄色的抗体DS加上维生素B12的粉色溶液会呈现出棕色的抗体DS（图三右）。因此推测该棕色的产生是由于培养基中的高铁以及高维生素B12导致了这种情况的发生。

抗体以及Fc融合蛋白的下游纯化工艺通常都是开始于Protein A的亲和层析，加上精纯化的离子交换和几步过滤构成。这些纯化步骤可以去除大部分的培养基成分，然而微量的金属元素和维生素还是有可能进入到最终的抗体DS中。有研究者评估了纯化步骤对于培养基中铁、铜和维生素的去除效果，发现高含量的铁和维生素很难在纯化中完全除去。虽然抗体纯化工艺通常都是一周内完成，但是环境因素如温度、光照和氧会对抗体产生影响。首先，柱层析的蛋白洗脱液都是通过紫外吸收来检测，其次，结合在柱子上的蛋白都是暴露于光照下，第三是储存在袋子中的抗体中间体也会有光照刺激。尽管这些因素不会在纯化好的抗体DS上立即显现，但是随着长时间的放置，最终的颜色可能会发生变化。

基于抗体的理化性质设计的抗体制剂开发越来越重要。抗体制剂通常包括缓冲液、盐、糖和表面活性剂等，这些辅料会增加抗体蛋白的稳定性。这些辅料自身的质量对于抗体制剂的长期储存至关重要。Singh等评估了四种来源的吐温80制成的抗体制剂在光照下的稳定性，研究表明了不同来源的吐温80对于抗体的光学稳定性影响差别很大，主要表现在抗体的聚集、酸性组分的产生、Trp和Met（甲硫氨酸）的氧化。另外，吐温80的稳定性也是很重要的一个考量，大家都知道吐温80在环境因素的影响下，会有水解、氧化和酶介导的降解。吐温80的氧化会产生ROS进而氧化抗体，可能会引起颜色的变化。组氨酸经常在抗体制剂中使用，但是组氨酸缓冲液对紫外和可见光都比较敏感，光照下容易产生聚集和颜色变化，有多个这样的案例报道。随着高浓度皮下注射制剂越来越流行，抗体制剂的颜色会相应加深，颜色的变化也会更加容易被注意到。一个挑战是如何证明深颜色的抗体制剂没有改变抗体的质量。因此更好的理解颜色形成和背后的机理在未来越来越重要。

CD培养基和高浓度制剂的流行趋势使得颜色变化的报道越来越多。抗体的颜色变化可能在生产工艺的任何阶段发生，因此早期的工艺开发时DS的颜色评估可能会对工艺优化和解决问题提供一些信息。上下游工艺开发的整体策略考虑对于减少颜色变化的风险很有必要。包括化学和生物成分、环境因素、设备的能力都对最终DS的颜色产生影响。根据前文的分析，对于上游工艺，需要特别注意培养基成分中的铁、维生素B12和B2。有报道粉色DS的问题通过减少CD培养基的B12可以有效减少而不影响抗体的产量。另外，维生素B12的异构体cyano-B12需要转换为hydro-B12才会有可能和抗体形成复合物，而该反应主要在波长400-600nm发生，因此在培养基配置、存储、培养工艺区域采用红光可以减少此类情况。另外，在培养基中加入一些抗氧化剂会有效减少ROS，从而减少高铁培养基带来的DS颜色变化。

减少抗体DS暴露在光照下也是一个通用的策略，这样避免光照引起的Trp氧化导致的颜色变化。制剂中加入自由基的猝灭剂如Met会保护抗体免受光照的影响。在制剂中加入Arg（精氨酸）也很常见，它通常会增强抗体的光学和热稳定性。