通过分离、生物学和理化测定等手段，确定一种未知病毒的确切分类地位及名称的过程。植物病毒鉴定中除了对病毒的生物学性状、传播方式及介体种类的鉴定外，还应观察病毒粒子形态、血清学试验以及有关的理化性状等，以确证这种病毒的种类及分类地位，甚至鉴定到病毒的株系。对于一种未知病毒首先应通过田间调查、症状观察、采集样品和接种传染试验等诊断它确系由病毒引起的植物病害，然后才能进行一系列的鉴定工作。
通过分离、生物学和理化测定等手段，确定一种未知病毒的确切分类地位及名称的过程。植物病毒鉴定中除了对病毒的生物学性状、传播方式及介体种类的鉴定外，还应观察病毒粒子形态、血清学试验以及有关的理化性状等，以确证这种病毒的种类及分类地位，甚至鉴定到病毒的株系。对于一种未知病毒首先应通过田间调查、症状观察、采集样品和接种传染试验等诊断它确系由病毒引起的植物病害，然后才能进行一系列的鉴定工作。因此诊断工作是植物病毒的初步鉴定。
首先应将采集的病毒样品在防虫温室内人工接种，观察症状表现过程和接种指示植物的症状特点，加以描述区分，并通过各种方法纯化分离单一的病毒。然后对病毒进行全面试验，用病毒的粗榨汁液测定寄主范围、症状的变化、传染方式和体外抗性等，以电子显微镜观察病毒粒子形态和初步的血清学试验等生物学性状。再其次，以提纯的病毒样品对病毒进行理化性状测定，包括电子显微镜的超微结构观察、血清学关系、沉降系数、核酸和蛋白质分析、氨基酸组成和顺序等。对病毒的每一个性状尽可能详细地比较研究，并掌握较完整的前人研究资料，才能正确地鉴定一种病毒。
植物病毒的样品，常不可能是单一的，很可能是混合病毒的侵染物，所以病毒的分离技术很重要。一般筛选混合侵染的病毒，采用草本指示植物进行接种试验。有些指示植物是枯斑寄主，则可以进行单斑分离，使分离物纯化。病毒分离物应遵循柯赫氏法则（Koch's postulate），即将分离物回接到原寄主植物上，仍表现出原来的症状。同时也证实该分离物的致病性，还可用电镜检视病毒粒子，或用血清学方法测试，使结果更为可靠。
有以下几个方面。①症状观察。观察田间自然发病的症状特点及其变化，详细记录并拍摄照片，同时将该材料接种到原来的健康植物上，观察接种后表现的症状及变化是否一致，做好记录，并加以比较。症状表现受环境、温度、光照、品种等的影响可能产生或多或少的变化。②寄主范围。不同病毒的寄主范围存在差异。接种侵染的寄主植物，在不同科、属、种或品种范围间的比较，是鉴定植物病毒的内容之一。有时即使同一植物，由于环境条件不同，其表现亦会有不同。差别很大的病毒，有时会产生相似的症状，所以这项试验的寄主范围不宜过大。试验所用植物材料必须一致，并应较全面的参考前人研究和有关文献，以便作比较分析。此外测定寄主范围的同时，可借此得到适宜于繁殖病毒的寄主，对该病毒的提纯和以后各项研究提供所需要的材料。③传染方式。有较多的植物病毒易于用粗榨汁，以摩擦接种方法进行机械传播试验。人工摩擦接种时，病毒榨汁可以加一些缓冲液，如磷酸、硼酸、柠檬酸、Tris、甘氨酸-氯化镁等。有时为保持特殊病毒材料的稳定，也可加入金属离子螯合物，乙二胺四乙酸（EDTA）或解单宁物质的烟碱、疏基乙酸盐、α-疏基乙酸及二硫苏糖醇等。还可在榨汁中加一些磨料，如金钢砂或硅藻土，或将磨料撒到接种植物叶面，使摩擦接种易于成功。此外植物病毒是否通过昆虫、螨、线虫、真菌以及种子花粉、苗木等传播，也是重要的内容。④病毒粒子形态和细胞病理解剖。用带病毒的植物叶片或嫩稍等以叶浸蘸法或病叶粗榨液，置于铜网，经负染后，于电镜下观察病毒粒子形态，测量大小，可以确定它是否是病毒或病毒类别。病毒初榨液也可进行免疫电镜观察（ISEM）更为简便快速，对长形病毒粒子较适用，用超薄切片技术的电镜观察，可以观察病植物细胞病理学解剖结构和细胞质中内含体或病毒粒子排列的晶体形态，一般实验室也可利用光学显微镜观察细胞中的内含体。⑤血清学试验。根据同源抗血清能对该植物病毒产生沉淀现象，进行与血清学有关的试验。如试管沉淀，琼脂双扩散和酶联免疫吸附试验。⑥病毒榨取汁液的体外的稳定性（或称抗性）试验。包括病毒的稀释限点、失毒温度和体外存活期，三项常规测定，这三项测定目前已不是鉴定和分类上必不可少的指标，但对病毒鉴定仍有一定的参考价值。其缺点一是某些病毒的上述性状并不稳定，二是有时不同病毒会表现出相同症状，比如大约有18种病毒组的病毒，其稀释限点都在10－4～10－5范围内。关于病毒的交叉保护试验至今用得并不多，原因是这种试验不稳定，有时不能反映出病毒间的亲缘关系，但有些试验表现出交叉保护的程度与血清学关系之间存在一定相关性。
对植物病毒理化性状的研究需要用提纯病毒的样品进行。提纯的植物病毒不但适用于电子显微镜观察病毒粒子，测定病毒沉降系数及血清学研究。特别是精提纯病毒，还可进一步用于病毒理化特性、蛋白质及核酸组分等测试。病毒的繁殖植物及生长时的条件适当与否，对提纯病毒的收获量关系相当密切。病叶上明显表现花叶的部分及嫩叶，病毒含量比老叶多。采收的病叶先置－20℃下冷冻过夜，利于榨汁时使病毒与细胞汁液分开，提纯效果亦好，匀浆时辅以特定的离子强度及pH值条件，可使病毒稳定，一般pH值以中性或微偏碱、偏酸为好。对于线状粒子的榨汁，以使用榨汁机或研钵，因高速旋转匀浆会使病毒长形粒子断裂。氯仿、正丁醇或表面活性剂如Triton X-100等，能促使植物细胞液与病毒分开有利提纯的纯度和产量。那些仅限于韧皮部发生的病毒，如大麦、小麦黄矮病毒，提纯难度较大，若加入纤维素酶、蜗牛酶及果胶酶等使组织碎解，亦有利于提纯。亲水化合物聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG，MW6000）有助于凝聚沉淀病毒粒子，减低离心中长形病毒粒子的断裂。精提纯过程中还要采用蔗糖密度梯度离心或用氯化铯（CsCl2）或硫酸铯（CsSO4）等进行平衡密度梯度离心等步骤。提纯制剂应在紫外光谱仪测定并计算A260/A280比值，若制剂不纯杂蛋白质较多，其比值下降。提纯后的病毒应再进行以下几项试验。
在电子显微镜下观察病毒粒子形态并测量其尺度（纳米，nm），以等轴病毒为例，其球形轮廓上存在着细微差别，是区分的根据之一。电镜观察病毒粒子并摄取照片。所用负染液一般用1%～2%磷钨酸水溶液（pH值为7.2）或0.5%～1%醋酸双氧铀水溶液（pH值为4.5～5.2），对于长形病毒粒子最好测量100个粒子的长度和直径，并画出分布矩形图，球形粒子除测量直径外，最好还要观察粒子的外观特征，如圆、卵圆、有节瘤、角边等。例如葡萄扇叶病毒（GFV）、蚕豆染色病毒（BBSV）、烟环斑病毒（TRSV）的球形粒子具有明显的六边形。黄瓜花叶病毒（CMV）的近球形，花椰菜花叶病毒（CoMV）有较大的直径略扁圆形，芜菁黄花叶病毒（TYMV）的球状有节瘤，菜豆金黄花叶病毒（BGMV）是双生病毒组（Geminivirus group）、两个角形球状粒子结合的联体病毒粒子。电镜用的铜网可用0.01～0.1M磷酸盐（pH值为7.0），溶入1%的戊二醛，或用蛋白A预处理，可增强吸附病毒粒子的能力和促进负染，有利于电镜观察。
奥氏琼脂双扩散法（Ouchterlong double diffusion test）适于球状病毒粒子，若用于测量长形粒子病毒宜在琼脂糖里加一点去污剂（SDS，十二烷基磺酸钠），以防止粒子凝集，并使粒子呈碎段而利于通过琼脂孔，琼脂双扩散法辨别近缘抗原间的关系，有以下几项原则：如沉淀线分叉则证明两种抗原性相异；如两沉淀线愈合，则证明两孔中抗原性相同；如果两条沉淀线部分愈合，一个线表现分枝，说明此两种病毒的交叉反应，它们之间存在着一定程度的血清学关系，免疫电镜是借助于电镜检测抗原和抗体特异性反应的技术，它较灵敏，快速，试样极微。酶联免疫吸附测定（EASA）近来多用间接酶联法。单克隆抗体（McAb）对病毒株系鉴定有其特殊的作用。
病毒的沉降系数和浮力密度在鉴定分类上亦可作为依据。例如同是直杆状病毒粒子的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）为185S，而TMV仅32.5S。又如同是直径30纳米的等轴病毒粒子，CMV仅有一个沉降组分，99S，而玉米细条病毒（MRFV）却有两个组分，54S和120S。应用密度梯度离心及超速区带离心，可获得病毒组分和沉降速率的数据。这些离心程序要用水平转头进行。配制蔗糖密度梯度缓冲液，有连续梯度和不连续梯度之分。提纯病毒加样顶端，按折射率和密度相关性图表，可查出收集物的分部折射率，换算出病毒粒子的浮力密度。
对一种病毒作进一步的研究，须做病毒核酸提取及分析，得到核酸类型、核酸链数、核酸含量、多核苷酸的数目及大小等主要数据。区分病毒的核酸是RNA还是DNA是很重要的。用提纯病毒，以酚-SDS或SDS-高氯酸盐提取病毒核酸，由于DNA在铯溶液中共浮力密度比RNA低，可将其区分，这些核酸对核酸酶（即DNost或RNast）的敏感性不同，用核酸酶处理这些制剂，并进行电泳测定。此外，若DNast混有RNast时常用加热（100℃，15分钟）处理以纯化DNast。对单链（ss）或双链（ds）核酸的测定，是根据融解特性及核酸酶和凝胶电泳进行。核酸链可依据它对限制性内切酶的敏感程度来区分，至于对多核苷酸数目及大小的测定，用Tris-磷酸盐缓冲液EDTA（loening，1969）或Tris-硼酸盐缓冲液EDTA做凝胶电泳测定。关于核酸分子杂交技术，近年来已应用于植物病毒的鉴定和分类。它是用标记互补的脱氧核糖核苷酸（cDNA）作探针的核酸杂交技术。依靠核酸链互补碱基对的特异性结合，测定碱基顺序同源性，目前除主要用同位素标记cDNA探针，并进行放射自显影外，也逐渐用非放射性核酸分子杂交技术，用生物素、亲和素（biotin-avidin）来标记探针，在硝酸纤维素膜（NCM）上进行斑点杂交。经过亲和素-酶联系统显现斑点。这种方法灵敏快速，如大麦黄矮病毒（BYDV）的cDNA探针鉴定此病毒，仅需1纳克的病毒含量即获明显结果。
对外壳蛋白质多肽的数目及其分子量测定技术，近年来亦用于病毒鉴定中，病毒蛋白质经SDS处理的降解为多肽，再经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳测定，观察电泳动时所形成不同迁移率的沉淀带。供试样品应为新提纯的病毒，或加少许螯合剂以减少植物蛋白酶的降解。测定的未知蛋白质分子量，是用已知蛋白质（marker proteins）的迁移率比较估算出来的。常用的是牛血清白蛋白（MW67000）；磷酸化酶A（MW94000）；β-半乳糖苷酶（MW116000）；卵白蛋白（MW43000）；胰凝乳蛋白酶原A（MW25700）；肌红蛋白M（MW17200）；细胞色素C（MW11700）及胰蛋白酶原T（MW，25700）等。
关于氨基酸组成和顺序的试验，在有条件或特别需要时，可以通过在SDS中限制性蛋白水解经凝胶电泳分析所得到的肽图（peptide mapping）进行比较。
在进行植物病毒鉴定的试验中，将有价值的研究数据和前人研究的文献作比较，对于植物病毒的鉴定十分重要，在所发表的文章中，应包括与该病毒密切有关的所有文献。
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