原文链接（https://www.labome.com/method/Western-Blot-Protocol-Troubleshootings-and-Survey-Results-on-Instruments-and-Reagents.html）
主要内容：文章详细描述了Western印迹相关仪器和试剂的比对结果，例如ECL发光信号检测试剂盒，凝胶制剂和预制凝胶，以及转移膜，数据来源于551个正式发表的Western印迹。 文章提供了典型的Western印迹方案，并讨论了Western印迹过程中的常见问题。
典型的Western印迹方案：
试剂和缓冲液：
1x RIPA缓冲液：50mMTris，150mMNaCl，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠，1%Triton X-100或NP40。
1x PBS缓冲液：137mMNaCl，2.7mMKCl，2.7mM Na2HPO4,2.7mM KH2PO4，pH7.4
BCA蛋白质测定试剂盒或Bradford蛋白质测定试剂盒
1.5MTris缓冲液（pH8.8）：90.68gTris-HCl至ddH2O，用HCl调节pH至8.8至最终500ml
1.0 M Tris缓冲液（pH6.8）：60.58gTris-HCl至ddH2O，用HCl调节pH至6.8至最终500ml
10%APS：在1ml ddH2O中的100mgAP。使用前准备好。
10%SDS：在100ml ddH2O中的10g SDS。
1xTris-甘氨酸缓冲液：25mM Tris，230mM甘氨酸（pH8.3），0.1%SDS。
3xSDS蛋白上样缓冲液：150mMTris（pH 6.8），6%SDS，30%甘油，30mM EDTA和0.2%溴酚蓝。缓冲液应该是新鲜制备，分装后4℃保存。
1x TTBS：25mMTris（pH 7.5）：0.15MNaCl，0.05%Tween-20,0.001%硫柳汞
1x转移缓冲液：3gTris，14.4g甘氨酸和200ml甲醇，将ddH2O加入1L
样品制备：
来自细胞培养的样品
贴壁细胞除去上清液，用1X PBS洗涤，除去残留的培养基。
加入预先冷的400ul-1ml 1X RIPA缓冲液/ 100mm培养皿。 在冰上孵育5-10分钟。
完全刮擦细胞并转移到冰上预先冷却的1.5ml微管中。
（可选）彻底均化或超声处理。
在12,000rpm，4℃下离心10-15分钟，收集上清液备用。
总蛋白应储存在-80°C备用。
组织
组织制备和定量。 将它们切成小块。
添加约500-600ul预冷的1x RIPA缓冲液/ 100mg组织。彻底均化组织。在12000rpm，4℃下离心15-20分钟。
蛋白质定量
Bradford测定和BCA测定。
SDS-PAGE
聚丙烯酰胺凝胶制剂
在顶部用堆积凝胶（5％）和凝胶梳（10或15个孔）制备6％-15％的分离凝胶。
样品加载和电泳将2X SDS蛋白上样缓冲液与蛋白质样品以1：1的比例彻底混合。
在加载凝胶之前，将样品在50-60℃预热。 预染色的分子量标记物用于监测蛋白质分离和蛋白质转移效率。在1X Tris-甘氨酸缓冲液中以60-120V运行凝胶1-3小时。
蛋白质转移
将蛋白质转移至PVDF或NC *膜用于抗体检测。
在1X转移缓冲液中预先润湿材料，如凝胶，Whatman纸和海绵。
PVDF膜应在甲醇中孵育10s-1min，然后移动到1X转移缓冲区。
堆放材料如下：表壳（黑色边），海绵，Whatman纸，凝胶，膜，Whatman纸，海绵，表壳（透明面）。放置在黑色面朝黑的转印装置中。使用冷的1X转移缓冲液在冷却环境中转移。 应根据印迹系统制造商的建议优化转移电流和时间。
*切勿将NC膜与甲醇一起孵育。
将溶解在1x TBST中的5%脱脂牛奶中的膜在25℃下封闭1小时（或在4℃下在振荡器上过夜）。与抗体孵育在推荐稀释度下用1X TBST + 3％BSA稀释的一抗或根据结果优化稀释。在4°C孵育过夜或更长时间或在室温下孵育4小时。
回收第一抗体并在4°C下储存。 然后在室温下在振荡器上将膜洗涤3X 5-10分钟。
在1X TBST中稀释第二抗体并将膜在室温下孵育1小时或在4℃下在摇床上孵育2-4小时。在室温下在振荡器上在TBST中洗涤3X 10分钟。
ECL +系统和X射线胶片用于HRP缀合的二抗。
问题与解决办法
1.问题：我打算对拟南芥自噬蛋白中的天然蛋白进行Western Blot。目的蛋白质和参考基因（Tubulin）同时检测。还是在两个不同时间对蛋白进行印迹，用Tubulin洗涤后再洗涤二次HRP抗体？另外，我想检测自噬天然3/4蛋白的表达，我可以在一个膜上进行所有吗？
答：您不应该尝试同时检测所有蛋白质。在使用第二种一抗之前，您应该去除一抗和二抗。即，用针对您感兴趣的蛋白质的第一抗体和第二抗体进行印迹，用ECL检测，然后用剥离缓冲液剥离一抗和二抗，然后用微管蛋白抗体及其二抗进行印迹，并检测。在剥离过程中，PVDF膜通常比硝酸纤维素膜更好地保留蛋白质。 PVDF膜的供应商应为您提供有关剥离缓冲液（温和或苛刻）和方案的信息。您应该能够执行几次印迹/剥离循环（一般最多三次）。每次在印迹之前，您可以使用Ponseau S染色检查印迹，以便在您不确定时可视化样品蛋白质。请注意，由于剥离，印迹上的样品蛋白会丢失。
没有信号，可能的原因：
用于检测的错二抗。 （确保一抗的宿主）
低浓度的一抗/二抗。 （提高浓度再试一次）
一抗不识别被检测物种中的蛋白质。（检查一抗的特异性）
加在凝胶上的蛋白质量太少。 （增加样本量）
转移效率很低。 （修改转移程序的操作。确保PVDF与甲醇预孵育。转移后干燥PVDF以确保蛋白质与疏水膜的结合）
一抗已被使用过多次。 （使用新稀释的一抗）
阻塞时间太长或洗太多次。 （减少堵塞时间和洗涤时间）
检测套件不起作用。 （使用阳性对照并确保检测试剂盒正常工作）
叠氮化钠可以抑制二抗。 （避免在稀释缓冲液中使用叠氮化钠）
与一抗或二抗的孵育时间太短。 （延长孵化时间）
SDS加载缓冲区可能已过期。 （使用新制备的SDS上样缓冲液）
SDS上样缓冲液和样品裂解液混合均匀。 （剧烈涡旋）
高背景：
阻塞时间太短或使用阻塞缓冲液错误（延长阻断时间或用BSA替代脱脂牛奶，或制作鲜奶溶液）。使用BSA，脱脂脱脂乳，偶尔使用来自山羊或兔等的全血清来预孵育膜，以使膜上的任何非特异性结合空间饱和。一旦非特异性结合空间饱和，第一抗体将仅结合特异性抗原。 BSA含有一种蛋白质，白蛋白。牛奶含有数百种蛋白质，酪蛋白是其主要成分，因此可以阻断所有潜在的非特异性结合位点。因此，牛奶优于BSA，也更便宜。大多数一抗不太可能与白蛋白或酪蛋白发生交叉反应。如果任何没有蛋白质的区域具有高背景，则阻塞步骤可能无法正常工作。
高浓度的一抗/二抗。 （降低抗体浓度）
洗涤不足。 （增加洗涤次数）
孵化温度太高。 （确保一抗在4°C孵育）
错误的膜或膜干燥了一段时间。 （防止膜干燥）
较高分子量的高背景可能表明还原剂/ SDS /样品加热未正确完成。
非特异性信号
高浓度的一抗/二抗。 （降低抗体浓度）
内源性免疫球蛋白，特别是在组织裂解液中[2]。如果没有一抗的对照运行，该信号应该持续。用例如蛋白G琼脂糖预先清除内源性免疫球蛋白，使用专门的二抗如TruBlot，或加热等其他治疗可以帮助减少来自内源性免疫球蛋白的非特异性信号[2]。
脏兮兮或模糊的乐队
凝胶的平衡时间不足或凝胶与膜之间的接触不均匀。 （确保凝胶没问题并改善转移程序）
秃头斑点
凝胶和膜之间的气泡。 （确保凝胶和膜之间没有气泡）
带尺寸与理论重量不一致
抗体特异性差。 （改变一抗）
一些蛋白质的迁移可能与其理论重量完全不同。
未能揭示可能的翻译后修改
通过SDS-PAGE无法解析向蛋白质分子引入负电荷的翻译后修饰，如聚（ADP-核糖基 - PAR链）[3]。然而，它们可以通过CTAB-PAGE分离揭示[3]。 CTAB，西曲溴铵（（C16H33）N（CH3）3Br，十六烷基三甲基溴化铵，十六烷基三甲基溴化铵）是胺类阳离子季铵表面活性剂。
溴化一铵（monium bromide），是一种胺基阳离子季铵盐表面活性剂。
Labome对Western blot相关仪器和试剂的调查
Labome调查文献以了解试剂和仪器的常见用法。
信号检测
化学发光是Western印迹中常用的信号检测方法。表1列出了主要供应商及其主要品牌，以及Labome调查的正式出版物中的引用次数。 GE Healthcare及其各种Amersham ECL试剂盒和Thermo Fisher Pierce SuperSignal West试剂盒主导了这种Western印迹试剂的提供。 GE Healthcare Amersham ECL试剂（Plus最常被引用。注意：自2014年10月4日起，GE医疗集团已停止使用Plus;当前版本为Prime）用于研究果蝇中CK2激酶的功能特性[4] ，Vav2和Vav3在皮肤癌中的作用[5]，白藜芦醇对肌肉中线粒体生物合成的影响[6]，Erf2在蛋白质棕榈酰化中的调节作用和粟酒裂殖酵母的减数分裂[7]，sFLT-的作用1维持小鼠模型中的无血管光感受器层[8]，α-突触核蛋白在突触囊泡模拟聚类中的作用[9]，信息素配体[10]，FGF21在延长小鼠寿命中的作用[11] ]，在脊索动物胚胎中建立尖锐的边界[12]，以及转录终止的调节[13]。截至2014年10月，GE Healthcare提供三种版本的ECL套件：常规ECL，Prime和Select，基于敏感性和信号持续时间。图1列出了GE Healthecare的选择指南。
预制凝胶
SDS-PAGE中使用的凝胶可以由丙烯酰胺和其他化学品新鲜制成，或者可以使用来自商业供应商的预制凝胶。 Life Tech和Bio-Rad是预制凝胶的两个主要供应商（表2）。 Life Technologies NuPAGE Novex Bis-Tris预制凝胶（大多数为4-12％）用于研究果蝇中CK2激酶的功能特性[4]等[14,24]。 Life Technologies NuPAGE Novex 3-8％Tris-醋酸酯凝胶用于研究果蝇中CK2激酶的功能特性[4]和Wnt /β-连环蛋白信号传导对端粒酶的调节[25]。 为了研究caveolar coat complex的结构组成，采用了Invitrogen公司的NuPAGE 4-20％Tris / Glycine gel进行免疫印迹实验[24]。 Bio-Rad 4-15％SDS-PAGE凝胶（目录号5671084）用于研究连接[26]。
原创： 走心科研小助手
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