现代全脑成像技术的进步，使脑图谱与大容量数据收集保持同步变得至关重要。近来，多科研机构正在对小鼠脑的细胞类型和神经连接进行研究，并跨模态、空间尺度和多脑区进行收集大量数据。然而，成功地整合上述数据需要一个标准的 3D 参考图谱。为此，美国艾伦脑科学研究所发布了小鼠脑 3D 图谱 - 通用坐标框架第三版（CCFv3），它可以用来分析、可视化、整合多模态和多尺度的 3D 数据集。
目前标准的 2D 小鼠脑图谱，如艾伦参考图谱（ARA）和小鼠脑立体定位坐标（MBSC）。其注释是在单个平面的单一参考脑切片图像上绘制的，染色后以细胞分辨率的光学显微镜成像。传统的脑区分割基于细胞结构或髓鞘结构进行染色，脑区划分也可以利用不同的基因表达，脑区间的连接模式与功能性质。因为每一种模态都可能揭示某些大脑区域的独特特征，当它们一起使用时，有望极大地改善结构描述。然而，还没有系统地整合多模态的哺乳动物脑图谱。此外，虽然之前艾伦研究所已发布 3D 图谱的第一和第二版，但仍然存在两个主要问题：①在非冠状平面将冠状注释的 2D 结构转换成 3D 体积引起图像失真；②目前大规模的数据生成工作需要高的细胞分辨率图谱。本研究中发布的 CCFv3 正好解决了上述的局限。
来自美国西雅图的艾伦脑科学研究所的 Julie A. Harris 和 Lydia Ng 团队在 Cell 发表了题目为 The Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework: A3D Reference Atlas 的研究论文，为我们详细解析了 CCFv3 如何将每个半球的小鼠脑划分成 43 个脑新皮层区，329 个皮层下灰质结构，81 纤维束和 8 个脑室结构。
由于每只小鼠的大脑在体积和结构上存在细微的差异。CCFv3 是对 1675 成年小鼠脑使用串行双光子断层扫描成像 (STPT) 进行构建成的整体均值的艾伦小鼠大脑连接图谱，其遵循了人体 MRI 为基础的群体均值模板的方法。作者运用迭代过程，将每个样本变形登记到模板中，取所有样本的平均值，并计算出所有样本的平均变形场，然后将其反转并应用于创建的平均图像。该算法一直持续到迭代间平均变形场的平均幅值之差降至某一阈值以下并趋于稳定。
具体来说，图 1A 显示了收敛到具有明显的解剖细节的清晰的平均图像。为了提高计算效率，该方法首先在 50μm 分辨率下应用，直到会聚，然后在 25 μm 分辨率下进行处理，最后在 10 μm 呈现具有解剖结构的 3D 图谱模型。在 10 μm 体素分辨率下，平均模板包括 5.06 亿体素（它的三维是 13.2 mm ´ 11.4 mm ´ 8 mm）。最终的平均模板包含许多可区分的、详细的、解剖的特征，与单一样本 STPT 的模糊结构相比，桶状皮层在平均模板中非常地清晰可见。这说明了，平均模板提供细胞尺度的分辨率，合适的 3D 参考大脑的分割和注释。
平均模板脑的注释是通过协调的、迭代的工作流来完成。①作者通过回顾以前发表的图谱和文献，对平均模板和五种多模态参考数据集（转基因小鼠数据的 STPT 成像；来自艾伦连接图谱的轴突投射数据；免疫组化和细胞结构染色；艾伦鼠脑图谱的原位杂交数据）进行可视化分析。②神经解剖学家根据结构的大小和形状，按一定的间隔在冠状面、矢状面和水平面上勾画出每个结构。③这个编织的结构被插图专家填充、细化和平滑处理，然后被神经解剖学家验证。④一旦达到一定数量的三维重建，个体和局部结构被合并。合并后，小的重叠和间隙被固定，因此所有的体素被分配到一个单一的大脑结构。⑤体素标签在一个半球完成并翻转生成对称的 CCFv3，最后由神经解剖学家进行评估。
绘制整个大脑新皮层的边界。作者利用 Calb1-Cre（Calb 在浅皮层表达）和 Fezf2-CreER（Fezf 在深部皮层表达）小鼠区分深、浅皮层；在冠状切面上，皮层与梨状区域的背侧分界；在矢状面上，与后下托和前方区的后方分界；在水平面上，与嗅球的后方分界。作者直接在这些 2D 视图上绘制边界，如下面描述集成数据，然后通过沿着流线从表面外推，将表面图转换为 3D 体积块。首先将新皮层分成初级视觉区、听觉区、躯体感觉区及后皮质区。随后通过转基因鼠标记将 4 分区进行细分（如将视觉区分成 9 个小分区）。作者从顶部视角重构了 31 个新皮层区，从侧视角重构了 33 个分区。从所有的表面观，小鼠新皮层总共被分为 43 个亚区。此外，作者还通过组织学数据并运用 5 种转基因鼠（均在新皮层的每一层有特异性表达的基因），将新皮层分为 L1、L2/3、L4、L5、L6a 和 L6b 层次。且这些脑新皮层的 6 层与 43 个皮层分区相交叉，形成了 242 个结构体积块。
紧接着，作者在又描绘出 329 个皮层下灰质结构，包括在 11 个主要的脑区中。作者还是从五种多模态参考数据集来描绘其边界。以 329 个结构中的中脑脚间核（IPN）为例，首先回顾已有的图谱与文献（IPN 细分成 7/8 个亚区），作者通过 Nissl 或抗体染色、转基因表达、轴突投射 IPN 的标记及平均模板本身，将 IPN 分成 8 个亚区。作者也从冠状面、矢状面、水平面描绘出各亚区的大小、形状及位置。平均模板体积中的大多数体素是在对 329 个皮层下灰质结构进行细分后标记的，在脑灰质中还有一些间隙 (不标记体素)。
之后，作者又通过顺行示踪和抗体染色描绘了脑白质纤维束，通过比较平均模板和相应的顺行追踪（直接标记组成这些束的轴突）数据，可以很容易地定义这些白质束的轮廓和轨迹。作者三维重建了小鼠脑中的 81 个纤维束，明确了其位置、形状、大小和轨迹。同时作者主要基于平均模板的固有对比，结合相应的 Nissl 染色，勾画出脑室的 3D 结构，作者重构建了 8 个脑室及相关结构。
最后，与其余图谱相比，作者列举了一些 CCFv3 独特的结构：IPN 的亚区 IPRL 是首次被描绘；外侧膝状体（LGd）的背侧被进一步细分成 LGd-sh，LG-co，LG-ip 三个亚区；增加了视觉和听觉辐射、胼胝体的主体（ccb）、胼胝体上脑白质（scwm）等 4 个纤维束。
CCFv3 具有哪些优点呢？①图谱的图像查看器提供了在单个窗口中查看和导航多个数据集的能力，比较来自多个实验的不同表达或连接模式。②支持在 CCFv3 本体树中对感兴趣的结构进行链接浏览和可视化，或加载不同结构集的 3D 模型。③CCFv3 采集了高信噪比全脑高分辨率图像（CCFv3 空间分辨率是第二版图谱的 1000 多倍），更容易分辨解剖学细节的。④CCFv3 新增两个功能：原始图谱中查看注释（reverse mapping）和体积估计。⑤CCFv3 有空间坐标系统及有序的结构本体，可以以多分辨率的交互式访问图谱。当然也可以选择二维或三维方式来浏览。⑥CCFv3 还为分布于全脑的大规模电生理学实验及脑皮层宽视野钙成像提供解剖学背景。
构建三维结构的注释工作流（图源自 Cell ）
总的来说，本文通过对 1675 只 C57BL/6J 小鼠进行高分辨率平面串行双光子断层成像，对鼠脑解剖结构的三维脑图谱进行了升级。为脑研究工作者提供了一个数字化开放存取交互式图谱（全注释的解剖参考空间）。
启发与问题
1. 本研究非常值得推崇。作者升级了三维脑图谱，极大的方便了脑科学工作者。促进了脑科学的精细化发展。
2. 作者指出 CCFv3 没有包括：ARA 原位杂交的数据及少数转基因品系的实验目前只能通过下载获取。
3. 作者指出平均模板与头骨基准点（Bregma）的关系未知，因此，CCFv3 暂不适用于确定立体定位坐标。CCFv3 还需与传统的二维图谱相互借鉴使用。
4. 小鼠虽然是最常用的实验动物模型之一，但随着科研要求的精细化及小鼠部分功能不能更好地模拟人的生理功能，为此我们经常使用大鼠模型及非人灵长类模型。希望艾伦脑科学研究所今后也能致力于开发上述两种动物模型的图谱。
参考消息：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30402-5
文章来源：iNature 转载自丁香学术
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