在做实验过程中，我们总是碰到过各种问题，
小优这里整理了8个常见的，希望能帮到你。
文章有点长，需要点耐心~
1、DAB 显色时间如何把握？
1)、DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
2)、DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
3)、此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
4)、DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗 4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
2、免疫组化结果如何分析？
1)、阳性着色细胞计数法:在 40*光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组 3~6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
2)、灰密度分析法:通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
3)、评分法:通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1~4 分为0~25%,26~50%,51~75%,76~100%)，最终可以分数相加，再进行比较。
Tips：对 2 中的这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
3、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？
1)、由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
2)、修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高 pH 的等）。
3)、微波修复，我们一般用 6 min*4 次，效果不错。
4、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？
1)、一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。
2)、用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.
3)、现用现配，配好后4度避光保存。
5、石蜡切片和冰冻切片的比较？
1)、要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2)、冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3)、石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
6、一抗的选择要点和技巧是什么？
1)、单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2)、应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3)、种属反应性的选择（species reactivity）。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4)、种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。
5)、生产厂家的选择。
7、产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？
1)、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
2)、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
3)、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4)、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
5)、DAB孵育时间过长或浓度过高；
6)、PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要；
7)、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
8、免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？
1)、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
2)、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；
建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。
3)、组织切片本身这种抗原含量低；
4)、血清封闭时间过长。
5)、DAB孵育时间过短。
6)、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
7)、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
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