甘精胰岛素

sanofi 2018Q1，top1lantus甘精胰岛素，销售额663m，长效胰岛素，适应症I型糖尿病，能持续释放18-26小时，预灌封包装形式，每天皮下注射一次，300单位约180元/支，国内主要是甘李药业和珠海亿邦制药，150元/支，医保目产品，胰岛素可以说是甘李药业的唯一产品，能做出来甘精胰岛素并打入赛诺菲的市场还是不错的，但是一枝独秀肯定是不行的，如果有更新换代的产品马上就会受到巨大的冲击，用胰岛素赚的钱抓紧在胰岛素方向纵深研发或者拓宽产品线才能持续发展。
科普一下甘精胰岛素的生产工艺。
在胰岛β细胞的细胞核中，第11对染色体段上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核转移向细胞浆的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链-胰岛素原（proinsulin PI）。胰岛素原进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去31/32/60三个精氨酸连接的链，断链生成C肽，同时生成胰岛素，分泌到B细胞外，进入血液循环中。胰岛素A链21个氨基酸，B链30个氨基酸，A链6位和11位的半胱氨酸间形成一个二硫键，A链7位和B链7位的半胱氨酸间形成一个二硫键，A链20位于B链19位的半胱氨酸间形成一个二硫键。
大肠杆菌属原核生物系统，不会对肽链进行修饰，但是可以生成简单的二硫键，酵母属简单的真核系统，常用表达抗体的哺乳细胞则属于高等的真核系统，真核系统会对蛋白进行简单的修饰，更接近人体蛋白形式，同时伴随着生产效率越来越低，生产条件越来越苛刻。胰岛素具有两个利于通过大肠杆菌生产的特点，第一是翻译以后不需要糖基化修饰，第二是是一个相对小的分子，由于C链的存在，使胰岛素原在体外能形成天然的空间构象，使得正确折叠率达80%。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系，都可形成包涵体。事实上，内源性的蛋白质，如果表达水平过高，也会聚集形成包涵体。因此包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果。其中大部分是克隆外源蛋白的表达产物，具有正确的氨基酸组成，但空间构象大多是错误的，因此没有生物活性。
甘精胰岛素的A链21位由天冬氨酸（Asn）变为甘氨酸（Gly），B链的30位后加两个精氨酸，赛诺菲，物质专利US5656722，2014年到期。表达甘精胰岛素的菌种是Escherichia coli(K12)，根据修改后的甘精胰岛素的氨基酸序列加上合适的酶切位点后按大肠杆菌密码子偏爱性设计DNA序列，找专业的厂家合成核苷酸序列，设计引物，进行pcr扩增，pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳检测分离。扩增后的母的基因加到质粒上转入大肠杆菌进行表达，先用大肠杆菌表达含A、B、C肽的胰岛素原，含二硫键的胰岛素原形成包涵体，包涵体结构致密，采用破碎或者高浓度的变性剂处理收集蛋白。再经过酶切处理切去C肽，得到终产物甘精胰岛素。中间需要经过复杂的上游基因工程技术，和下游分离提取技术，都是常规的生产技术，多次试验就可以得到优化的参数。
甘精胰岛素在中性pH条件下水溶性差，在pH4条件下完全溶解，皮下注射后酸性溶液中性化，甘精胰岛素析出形成微晶形态并持续缓慢释放使血药浓度在24小时内呈现平稳的浓度，每ml甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100单位（3.6378mg），10mg注射液规格含辅料30ug锌，2.7mg间甲苯酚， 20mg85%的甘油 ，20ug聚山梨酯20，用盐酸或氢氧化钠调pH至4.0。3ml预灌封笔芯注射液规格辅料30ug锌，2.7mg间甲苯酚， 20mg85%的甘油，用盐酸或氢氧化钠调pH至4.0。