设计siRNA基因序列详细教程 – sci666

小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA），又称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长21-23个核苷酸的双股RNA。

小干扰RNA 是被广泛公认的能够沉默许多或所有的基因的核糖核酸，其与靶向特异性的mRNA结合，通过RNA介导的沉默复合体RISC（RNA-induce siliencing complex）介导mRNA的降解，被RISC识别结合之后，siRNA发生解旋。RISC在siRNA的反义链指导下，寻找具有同源序列的内源性的mRNA，并在距离5’端10-11位剪辑之间切割mRNA，抑制其基因的表达或使基因沉默,阻碍蛋白质的表达,从而实现其功能。

那么问题来了，应该怎样设计一条满足自己实验要求的siRNA序列呢？

Part 1

初识siRNA序列设计真面目

相信只要有点生物学基础的人，对T、C、G、A四个碱基一定不陌生，但是设计siRNA序列可不是单纯地对熟悉的字母进行随机排列组合，对于初次接触siRNA序列设计的新手来说，要设计出一条合适高质量的siRNA序列，是存在很大困难的。那么，我们不防站在巨人的肩膀上，借助在线网站辅助我们完成siRNA序列的设计。

首先打开sigma网站用于初步查询拟设计siRNA的核苷酸序列（本文以SFRP1为例）

https://www.sigmaaldrich.com/catalog/genes/SFRP1?lang=zh®ion=CN#shRNA%20Products 

选择Description为“MISSION® shRNA Plasmid DNA”，Species为“human”的产品，如下图；

点击“价格”，出现以下界面：任意选择一个在CDS上的核苷酸序列，复制到word中；

因为：pLKO.1载体shRNA序列一般为：

Forward oligo:

5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG 3’

Reverse oligo:

5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’）

本例Sequence为：

CCGGCGAGATGCTTAAGTGTGACAACTCGAGTTGTCACACTTAAGCATCTCGTTTTTG

所以拟设计的siRNA序列初步确定为黄色高亮部分：CGAGATGCTTAAGTGTGACAA

Part 2

巧用NCBI网站验真伪

好了，看到这里是不是觉得设计siRNA序列也就那回事，一条完整的siRNA序列设计已经完成了呢？NO! NO!NO!当siRNA序列初步确定以后，还需要验证拟设计的siRNA是否在CDS区以及是否在同一个外显子上，以提高后期实验的成功率。这里主要介绍两种方法：

第一种方法：NCBI-Gene网站

打开网址：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=SFRP1，

输入基因名称SFRP1，选择物种来源 Homo sapien

根据搜索结果选择该基因（SFRP1）所在条目

点击SFRP1，进入以下界面

下拉找到mRNA and Protenins所在位置

 

若mRNA and Protenins项目下出现多个结果，则ctrl+F出现搜索框，搜索“longest”，Eneter键入，找到编码最长变体的序列；若只有一个结果，则可直接点击编号NM_XXXXXX.X，本例只有一个结果，可直接进入以下界面

下拉找到CDS所在位置

 

点击“CDS”进入以下界面；棕色标注即为CDS区，将其复制到WORD，通过查找工具，验证拟设计的siRNA是否在该区域，若不在该区域，则该siRNA序列不可用；若在该区域，记录siRNA序列的起始位置（本例为770-790，确定具体位置比较麻烦，可以用BLAST直接查找，具体操作步骤见第二种方法）验证siRNA序列是否在同一个外显子上（理论上来说sigma网站上给的shRNA序列都是商品化的产品，一般都没问题）

返回到上层页面，770-790正好在第一条exon上，没有横跨外显子，该条siRNA可用

 

第二种方法：NCBI-BLAET网站

打开网址

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，界面如下图

点击 “Nucleotide BLAST”,进入以下界面，首先在输入框输入拟设计的siRNA序列

然后Database选择“Human genomic+transcript”，最后点“BLAST”

得到BLAST result如下图所示

点击“Alignments”得到如下结果。以下图红色选框为例，首先确认匹配到的是自己的目的基因，匹配率Identities为100%时则可

最后 确认下这个序列是不是在CDS区，在不在一个外显子内，一条完整的siRNA序列就完成啦！

题外话

注意NCBI-BLAST 上的sequence ID要和NCBI-Gene上的ID一致，不然siRNA序列的具体位置会有差异，

BLAST 上的sequence ID为NM_003012.4，sbject为768-778.

Gene上的sequence ID为NM_003012.5，sbject为770-790.