撰文丨QY
责编丨迦溆
图片引自：https://www.medicalnewstoday.com/articles/318927.php
上世纪60年代初, Leonard Hayflick 发现在体外培养的正常细胞并不能无限增殖下去，在一定的代数后便会走向衰老和死亡，这一现象称为细胞的Hayflick极限【1】。这种现象可由多种因素触发, 如染色质端粒(Telomere)长度变短、外界环境刺激、DNA损伤和癌基因、抑癌基因的失调等【2】。p53/p21CIP1通路和p16INK4A/pRb通路介导了绝大多数细胞老化，在体外培养的细胞中，有一些细胞这些通路会被失活，从而越过这个界限（下图中的Senescence）。越过这个界限的细胞会继续增殖，进入下一阶段（下图中的Crisis），但是这会带来另外的一些问题，比如：端粒会进一步变短。此时细胞内会发生一系列的事件，比如：染色体末端的融合，基因组的不稳定等，大量的越过上一个界限的细胞将会在此阶段走向死亡，这一阶段称为Replicative Crisis【3】。然而，一些细胞也会越过这个极限，越过这个极限的细胞通常会恶性增殖，基因组极不稳定【4】。无限增殖的肿瘤细胞也必须要越过这两个界限，从而获得无限增值的能力。Replicative Crisis阶段也被认为是细胞发生恶性转换的最后一道防线。因此，研究此阶段细胞的生物学特征、分子机制以及其干预机制，无论是对于理解细胞增殖的基础生物学问题，还是肿瘤的发生发展，以及衰老的生物学基础，以及发展其干预措施都具有重要的意义。
来自美国Salk Institute 的Jan Karlseder教授长期致力于端粒以及DNA损伤修复领域的基础研究，并在相关领域取得了一系列研究进展。2015年在Nature杂志发表了题为：Cell death during crisis is mediated by mitotic telomere deprotection.的文章，报道了细胞在Replicative Crisis时期，染色体端粒的损伤会直接导致细胞周期的阻滞，以及细胞在有丝分裂中或者下一个细胞周期中死亡【5】，揭示了细胞在Crisis期死亡的相关机制。然而这一领域中，长期以来都认为在这一阶段细胞将走向传统的细胞凋亡方式死亡，但是缺乏相应的证据，这一特殊细胞时期其细胞死亡的方式及其具体的分子机制仍不明确。
近日，Jan Karlseder教授再次在Nature杂志发表了题为：Autophagic cell death restricts chromosomal instability during replicative crisis 的文章，阐明了Autophagy在这一时期中细胞死亡过程中的重要作用, 作者证明了在这一时期的细胞，端粒DNA的损伤会导致DNA释放到细胞质中, 这种释放到细胞质中的DNA能够被细胞内的DNA sensor： cGAS-STING 所感知，从而激活autophagy的发生，autophagy降解了细胞内的重要组分，从而导致这一时期细胞的死亡。值得一提的，在2018年10月份的苏州冷泉港亚洲会议上，Jan Karlseder教授作为Keynote speaker已经展示过这篇文章的相关data。
Jan Karlseder教授在研究Replicative Crisis时期的细胞中发现，进入Crisis时期的细胞中有大量的空泡状结构存在，这种空泡状结构非常像autophagy过程中的autophagsome以及autolysosome结构，这种结构的存在提示了autophagy在Replicative Crisis这一时期细胞死亡中可能起着重要的作用。因此，作者对这一现象进行了深入研究。作者发现，当细胞进入Crisis时期后，autophagy相关的蛋白：LAMP1, ATG5-ATG12以及检测autophagy的金标准LC3I-II的转化都显著升高，同时P62蛋白水平下降，这一时期细胞凋亡的marker并未有显著提高，这些结果都提示了autophagy过程在这一时期却是显著上调。
为了进一步证实autophagy却是在该时期的细胞中大量发生，作者使用mCherry-EGFP-LC3 （检测autophagy常用的工具 ，当mCherry-EGFP-LC3未与溶酶体融合时候，呈现黄色荧光，当LC3与溶酶体融合后，由于溶酶体内的酸性环境，EGFP被失活，不再发生绿色荧光，而mCherry可以继续发出红色荧光【6，7】）检测细胞内的autophagy flux 水平，同样发现在细胞进入Crisis时期后，细胞内的autophagy flux会显著升高（下图）。这些结果表明，autophagy会在细胞进入Crisis时期后显著升高，提示了autophagy在这一时期起着重要的作用。
Crisis 时期细胞中Autophagy 水平明显升高
由于autophagy对于细胞的作用是一把双刃剑，既可以促进细胞的死亡，在另外一些条件下（比如：营养缺乏等）会促进细胞的存活【8】。为了进一步探寻autophagy在这一时期细胞中的具体作用，即到底是促进了细胞在这一时期的死亡，还是帮助细胞“逃离”这一时期，从而发生恶性转变，获得无限增殖的能力。作者在多种细胞中分别敲低了多种autophagy相关的基因，抑制autophagy后观察细胞在这一时期的变化。作者发现，敲除autophagy相关基因，对于到达Crisis之前的细胞的分裂、增殖以及基因组的稳定性并无显著影响，但是，当细胞进入Crisis时期后，抑制autophagy会抑制细胞的死亡，促进这一时期细胞的生长，导致细胞大量的增殖。
以上的实验数据表明，抑制autophagy可以帮助细胞度过replicative crisis, 也就是说，在crisis期，细胞的死亡是依赖于autophagy的。因此作者提出了一个问题，这个过程中较高水平的autophagy是如何被触发的？细胞是通过一种怎样的机制感知到了细胞已经进入Crisis时期，并激活autophagy，从而导致细胞死亡，不再进行恶性增长。
作者接下来对这一问题进行了详细的探索，细胞进入Crisis时期的典型特征就是端粒的损伤，那么是否端粒的损伤就能诱导autophagy的发生，而不需要细胞进入Crisis时期？作者2015年Nature文章的发现， TRF2敲低会导致端粒的损伤形成telomere dysfunction-induced damage foci以及造成染色体的end-to-end 融合。作者发现，在未进入Crisis时期的细胞中，敲低TRF2就会导致autophagy相关蛋白水平的升高，P62的降低，以及autophagy flux的显著增强。作者通过这些实验证实了端粒的损伤确实会诱导autophagy的发生，这一过程并不需要细胞进入Crisis时期。另外，作者还在正常细胞染色体的不同位置引入DNA损伤，研究结果表明，在端粒位置的损伤会触发自噬反应，而在其他染色体区域的损伤则会引起细胞凋亡。这个结果进一步解释了所观察到的结果，还证实细胞凋亡并不是唯一能够因为DNA损伤而杀死致癌细胞的途径，也就是说，这种端粒的损伤诱导autophagy的产生也能促进细胞的死亡。
那么端粒的损伤如何被细胞所感知，又如何诱导autophagy的发生？端粒的损伤会导致细胞内的相邻染色体的融合形成融合染色体，这种染色体在细胞分离时候会具有两个着丝粒，在细胞分离时候不能正确的分离，导致DNA的断裂，将细胞核中的DNA释放到细胞质中，形成微核(micronuclei)结构。细胞质中的DNA以及微核的结构能够被细胞内的cGAS-STING pathway 所感知，从而介导细胞天然免疫下游信号通路的激活，另外，cGAS-STING通路的激活也能诱导autophagy的发生。作者发现，细胞质中的染色体片段，微核结构在进入Crisis期的细胞中逐渐积累，同时，细胞质中的DNA片段与cGAS以及mCherry-LC3以及P62都有非常好的共定位现象。提示了cGAS-STING pathway对于Crisis诱导的autophagy起着至关重要的作用。作者在细胞中敲低cGAS或者STING后发现，端粒损伤诱导的autophagy显著降低，同时，与敲低autophagy相关基因的表型一致，敲低的细胞能够更好地度过replicative crisis时期，进而获得无限增殖的能力。
作者通过以上的一系列实验数据，提出了在细胞面临telomere crisis的时通过autophagy通过降解一些细胞内关键的组分，从而诱导细胞走向死亡的全新的理论。为autophagy维护基因组稳定性提供了全新的证据支撑。另外，这也为一些以抑制autophagy过程为主的癌症治疗方法提出了新的挑战。当抑制autophagy后可能会帮助一些细胞度过replicative crisis时期，获得无限增殖的能力，因此需要重新审视autophagy在肿瘤的发生发展过程中的重要作用，简单的抑制autophagy作为抗肿瘤治疗手段是不完善的。
另外，为什么在染色体末端的DNA损伤会诱导autophagy而位于染色体其他地方的DNA损伤不会诱导autophagy也是尚未解决的问题，cGAS-STING与autophagy之间的Crosstalk等问题还需要更加深入以及细致的研究，从而为肿瘤等疾病的发生发展以及衰老等生物学过程提供新的理解，从而开发相应的干预措施。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-0885-0
参考文献
1. L. Hayflick, THE LIMITED IN VITRO LIFETIME OF HUMAN DIPLOID CELL STRAINS. Experimental cell research 37, 614-636 (1965).
2. A. Prieur, D. S. Peeper, Cellular senescence in vivo: a barrier to tumorigenesis. Curr Opin Cell Biol 20, 150-155 (2008).
3. W. E. Wright, O. M. Pereira-Smith, J. W. Shay, Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Molecular and cellular biology 9, 3088-3092 (1989).
4. W. Wei, J. M. Sedivy, Differentiation between senescence (M1) and crisis (M2) in human fibroblast cultures. Experimental cell research 253, 519-522 (1999).
5. M. T. Hayashi, A. J. Cesare, T. Rivera, J. Karlseder, Cell death during crisis is mediated by mitotic telomere deprotection. Nature 522, 492-496 (2015).
6. S. Kimura, T. Noda, T. Yoshimori, Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy 3, 452-460 (2007).
7. E. Tresse et al., VCP/p97 is essential for maturation of ubiquitin-containing autophagosomes and this function is impaired by mutations that cause IBMPFD. Autophagy 6, 217-227 (2010).
8. Y. Liu, B. Levine, Autosis and autophagic cell death: the dark side of autophagy. Cell death and differentiation 22, 367-376 (2015).
制稿人：子阳
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