随着手术、化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗方式的综合应用，癌症病人的生存期明显延长，如何进一步提高癌症病人的生存质量仍面临着巨大挑战。
循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作为一种潜在的肿瘤标记物，其检测低创伤性、可重复性，能为癌症病人的早期诊断、肿瘤负荷监测、药物疗效预测、复发转移及预后评估提供有效信息。
循环肿瘤DNA（ctDNA）概述
1948年，Mandel和Métais首次在人类血浆中检测出细胞外循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）。肿瘤病人体内存在的cfDNA，是由肿瘤细胞、炎性细胞等异常或正常细胞释放到血管中的游离DNA片段组成的。
cfDNA中，携带肿瘤特有突变的小部分DNA片段称为循环肿瘤DNA，其来源于肿瘤细胞并通过凋亡、坏死或直接分泌的方式释放进入循环系统。ctDNA的清除可能与肝脏和肾脏代谢有关，由于DNA片段大小、结构等不同，其半衰期从数分钟到数小时不等。
循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测方法
ctDNA检测也称作“液态活检”，其能全面的反映与肿瘤组织相同的突变基因组信息，包括点突变、基因扩增、拷贝数异常、过度甲基化等。其中TP53（tumor protein p53）、PIK3CA（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit alpha）和GATA3（GATA binding protein 3）三种基因突变的检出率较高。
目前，ctDNA的检测方法主要有数字聚合酶链式反应（dPCR）和二代测序（NGS）。
（一）数字聚合酶链式反应
dPCR是一种核酸分子绝对定量检测技术，即将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成上万个和数百万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量。
但是，dPCR只能分析评估单一的数量有限的碱基对改变，通量相对较低，仅用于对已知的特定基因进行定量检测。在dPCR的基础上，microfluidic PCR、ddPCR及BEAMing（bead emulsion amplification magnetic）等技术的进步提高了ctDNA检测的灵敏度。
（二）二代测序
NGS技术的发展实现了对全部基因或某些指定区域进行测序，提高了测序速度，降低了测序成本，并能发现未知突变序列，从而获取更多肿瘤遗传信息。目前，安全测序系统（safe-sequencing system，Safe-SeqS）和双向测序（duplex sequencing）可提高NGS检测ctDNA的灵敏度及特异度。
安全测序系统为目标基因增加一个称为UID（unique identifier）的特定编码的序列，然后进行扩增，增加目标基因的浓度，即可有效提高后续测序的灵敏度。双向测序类似于安全测序系统，不同在于最终扩增的是目标基因的双链并同时测序，以显示目标基因的真实突变。有研究表明，在cfDNA足量时，NGS的灵敏度（0.02%~5.00%）取决于测序深度。测序深度越高，相对应的灵敏度及特异度越高，得到的数据信息量也越大，同时时间及成本也会增加，应根据研究及应用需要合理选择。
扩增子测序属于NGS技术，其原理是边合成边测序。用不同颜色的荧光标记4种脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP），当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同荧光，根据计算机软件来处理捕捉到的荧光信号，可以获得待测的DNA序列信息。针对多种DNA，通过多重PCR技术，把ctDNA携带的特殊基因突变区段扩增出来，进行高通量测序和分析。
肿瘤个性化分析深度测序（CAPP-Seq）是新的NGS技术，CAPP-Seq基于捕获技术的进步，可以用于特定肿瘤类型的大部分病人，并可以探测几乎所有主要类型的突变。在测序前通过杂交靶向基因成反义寡核苷酸来丰富基因组，从而增加了检测的敏感度，能有效分析不同病人的ctDNA。
目前，ctDNA检测方法及结果处理缺乏统一的标准，仍不能广泛应用于临床，但二代测序检测相关指南的出台即将改观此现象。
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