科研杂谈|RNA提取那些不容忽视的操作细节

“为什么人家提RNA一提一个准，换了我就是死活提不出来（Orz），难道我就是传说中的RNA绝缘体？”相信怀有这种疑问的小伙伴不在少数，那么RNA提取过程成功与失败的决定因素到底在哪儿呢？

本期我们先来看看RNA提取之经验总结篇：

1、实验环境污染。人体自然脱落的皮屑或是皮肤携带的细菌霉菌等微生物都可能成为RNA酶的来源从而影响RNA的提取。因此，在实验过程中要养成严谨的无菌操作习惯，防止微生物污染。

2、操作时勤换手套，带好口罩，在冰上操作时动作要迅速。

3、保证所提RNA质量的关键的一步：加氯仿离心后出现三分层，上中下分别为RNA、DNA与蛋白，分离RNA时需注意防止DNA混入RNA。因此，离心后不要马上吸取RNA上清液，先移取中层DNA和下层蛋白，然后将剩下的下层油相（10%~15%）短暂高速离心后再吸取RNA上清液。

4、不同的样品前处理

（1）提取细胞样品时：细胞离心后不能立马加入Trizol试剂，因为成团的细胞加入Trizol试剂后，外围细胞会先施放出大分子DNA聚积成团，干扰成团里层细胞的裂解。这时，即使用加样枪或针头反复吸取也无法彻底打断已成团的DNA。

若提取样品来自培养的贴壁细胞，吸取培养基后用PBS洗涤细胞两次，而后直接加入Trizol试剂；若提取样品来自培养的悬浮细胞，需先连培养基一起离心，然后用PBS洗涤细胞两次后加入5~10%的PBS重悬细胞，待重悬完全后再加入Trizol试剂。

（2）提取组织样品时，常用液氮研磨法，需充分研磨至粉末状后再加入Trizol试剂。该过程需注意以下三点：

①研磨器皿需高压灭菌烘干后，于-80℃放置过夜预冷冻；

②组织块的表面积尽可能大，避免成易飞出研钵的球状；

③液氮用量要足，需让组织块完全冻透后，一次性将其研磨好（避免二次添加液氮导致样品飞溅）。

5、Trizol试剂能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶，故加入Trizol后样品RNA不会被RNA酶消化。后续实验所需的玻璃器皿或塑料器皿不可含RNA酶，可将玻璃器皿于150℃烘箱中烘烤4h，塑料器皿于0.5 mol/L的NaOH中浸泡10 min，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

6、用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA时，根据沉淀的多少加入相应体积的溶液。初次实验时，可先少加溶液，若浓度过大再稀释。

7、RNA提取完后需跑电泳检查有无DNA污染和RNA降解，然后存于-80℃。

8、实验后超净台需用70%乙醇擦拭，然后用DEPC或Erasol除去空气中的RNase。提取RNA所需的Tip和EP管需提前用0.1%的DEPC或Erasol水处理以除去RNase，DEPC处理还需高压。

9、RNA贮存在70%的乙醇中远比贮存于DEPC水中稳定，在-80℃可保存数年，有些甚至10多年后还可以用，具体有两种保存方式：

（1）乙醇或异丙醇沉淀后如不立马用，可直接换成70%乙醇于-80℃保存，用时再分析RNA的质量和数量。

（2）常规处理后，检测完RNA的质和量后加入3倍体积的无水乙醇，于-80℃保存。

10、Trizol试剂提取RNA所用的一次性试管要确保没有破损，可耐受12000g的离心力。

11、实验用水必须用DEPC处理过的无RNase水，配制方法为：在去离子水中加入0.1%的DEPC，摇过夜后，高压分解残留的DEPC。Trizol提取RNA时要注意戴手套和护眼罩，因其含有酚等有机溶剂，所以操作要在通风橱中进行，以避免人吸入，同时温度应控制在15-30℃，所有与Trizol试剂有过接触的器皿都要用水浸泡。

由此可见，RNA的提取操作细节很重要，细节决定成败！先从规范严谨的实验操作上扼杀失败的可能~科研er从不认输，冲冲冲！