我们在细胞培养时大部会以贴壁的形式生长(除了取自血、脾或骨髓的细胞),使用的完全培养基中的血清,含有许多带阳性电荷的促细胞附着因子(层黏连蛋白 Laminine、纤维链接蛋白 Fibronectin 等胞外基质),能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上,并形成键结、贴壁伸展。也就是所谓的~细胞消化Cell Detachment
常见细胞消化法有三种
机械消化法、离子螯合法、酶消化法
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机械消化法
直接用液体吹打或用刮刀,施予外力让细胞与培养底物分离;适用于贴壁性弱的细胞传代,但相较于其它消化方法,这种外力无法量化控制,细胞分散效果差,且可能会造成大量细胞破损,使内容物释放到培养基,进而影响细胞传代状态。
▲细胞刮勺
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离子螯合法
细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结,当然也包含各种黏附蛋白(例:整合素、钙黏着蛋白、桥粒等),螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下,抽离这些离子,使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用,让细胞较容易在施予外力时,脱离培养底物并促进细胞分散。
0.02% EDTA是细胞传代最常用的离子螯合剂,在37℃作用效果最佳(消化较敏感的细胞可在4℃作用),适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。
但EDTA无法用血清终止其反应,所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液(如:PBS)清洗离心,以免影响后续细胞贴盘效果。
▲ EDTA(黑)能螯合二价离子(红)
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酶消化法
用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质,适用于消化贴壁性稍强的细胞。
什么程度算消化完全呢?
绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可:
吸去胰酶后,残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞(绝大部分1min不到)。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞,连续这样传代,对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去,胰酶润洗吸去,然后37℃消化。比较难消化的细胞(润洗方法5min还不能消化),这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育。
消化的影响:
常规的细胞实验(增殖,凋亡,迁移,分化之类的),受消化影响不是很大,如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化(难消化细胞例外)即可。但少数实验,比如病毒包装,对细胞代数,对细胞状态要求极高。这个时候,胰酶消化,就是润洗,都会对细胞包装病毒的能力有影响,传代次数一多,细胞包装能力就会逐渐下降(当然也有其它因素影响包装效率)。这个时候都不用胰酶消化,用一些盐溶液(不是EDTA液)即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性,来使得细胞脱离基质附着表面,但不切割任何蛋白。
EDTA的作用:
许多人不用胰酶,只用EDTA,或者用trypsin/EDTA联合作用。这里要明白,trypsin切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白,而EDTA通过螯合Ca离子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA,或者对付特别难消化的细胞,添加多一些EDTA,就是这个道理。一般不要试图延长消化时间(如果10min还消化不彻底的话),而应该想其它办法。
PBS洗涤注意事项
消化之前用PBS洗涤,是常见的操作,因为Serum含有抑制trypsin的蛋白。但这里面也有学问可以讲,对于一些难消化细胞,那么可以配制不含Ca,Mg离子的PBS,因为这些离子也会抑制trypsin的活性。但对于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞,不需要配制如此溶液。
来源:CellMax俱乐部
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