关于细胞毒性实验及共聚焦成像，你还需要了解这些！

细胞毒性实验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。

常用MTT法或者CKK-8法检测，另外也可以通过Live/dead双染色法进行细胞成像，更直观的记录细胞存活情况。

一、MTT法

1.原理

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在特定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

2.特点

灵敏度高、经济；由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

3.应用

3.1 含壳聚糖纳米颗粒(CSNP)的聚乙烯醇(PVA)纳米纤维和载药的氧化石墨烯-磁铁矿(GO-Fe3O4)纳米复合材料，用于烧伤和糖尿病创面的智能敷料^[1]

Majid Abdouss研究团队采用静电纺织法制备了含壳聚糖纳米颗粒(CSNP)的聚乙烯醇(PVA)纳米纤维和载药的氧化石墨烯-磁铁矿(GO-Fe₃O₄)纳米复合材料，用于烧伤和糖尿病创面的智能敷料。壳聚糖纳米颗粒和GO-Fe₃O₄纳米复合材料作为载体存在于纳米纤维中，调节了药物在纳米纤维膜中的释放。在释放的早期，GO的存在阻止了突释，而磁铁矿的存在可以刺激伤口愈合。此外，纳米纤维膜对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌性能。

P80CN20-TGT2、P80GF5-T-GT2和P80CN20GF5-T-GT2纳米纤维膜的细胞毒性和细胞存活率分别为83.25±2.87%、98.69±0.60%和82.23±1.56%。壳聚糖纳米颗粒与GO-Fe₃O₄纳米复合材料所形成的纳米纤维膜具有低毒性。

3.2 FeCo-PEI-PLA-PEG-FA/Glu (NPsAB)纳米颗粒用于基因治疗和化疗^[2]

耐药是化疗药物治疗癌症的一大挑战。在这场战斗中，使用siRNA给药是一种有效的策略。Hossein Ali Ebrahimi研究团队将siRNA和紫杉醇(PTX)整合到一种纳米载体中，通过将叶酸(FA)和葡萄糖(Glu)偶联到载体表面，优化了载体对肿瘤组织的选择性。以FeCo-PEI纳米粒子和聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物为载体，构建了纳米载体结构。与NP_SA/siRNA/PTX和NPsB/siRNA/PTX相比，因为FA和Glu的多靶点特性NPsAB对癌细胞的抗癌作用显著增强。

比较不同纳米颗粒的体外细胞毒性，如上图所示，siRNA/PTX纳米粒(NPSA、NPsB和NPsAB)具有良好的生物相容性，与MCF-7和BT-474细胞孵育48小时后没有明显的细胞毒性。

二、CKK-8法

1.原理

WST-8，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

2.特点

适合悬浮细胞、对细胞的毒性小、即开即用、灵敏度高、重现性好、适合于高通量药物筛选应用；与MTT法相比，CCK-8的价格比较贵，CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易漏加或多加。

3.应用

唐本忠院士团队深圳大学AIE研究中心王东教授课题组提出了一种“三管齐下”的策略，定制了一个高效的癌症治疗多功能纳米平台，该平台由具有优异光热转换能力的Ti₃C₂纳米片、具有AIE活性的光敏剂TBFT以及具有扩展激发波长能力的上转换纳米颗粒(UCNPs)组成。通过荧光成像/光声成像/光热成像（FLI/PAI/PTI）三模式成像引导光热疗法结合光动力疗法（PTT/PDT）从而实现高效的诊疗一体化^[3]。

通过CCK-8实验研究TU NPs和TUT NPs对4T1细胞的杀伤力。首先，TU NPs和TUT NPs在黑暗中是无毒的，即使其浓度高达50µg mL^-1，显示了它们优异的生物相容性。TU NPs的半数生长抑制浓度IC₅₀值大于50 ug/mL，而TUT NPs的IC₅₀值仅为7.8 ug/mL，显示了TUT NPs在PDT和PTT方面的卓越的协同作用。

三、共聚焦成像(CLSM)

1.原理

使用可以结合DNA的荧光染料与细胞进行孵育，不同的荧光染料会分别进入活细胞与死细胞，从而呈现出不同的荧光。因此，活细胞和死细胞能通过成像系统拍摄到的荧光信号被轻易区分和识别到。

2.特点

信号强，缩短曝光时间，成像速度更快；适用于各种细胞类型，应用广泛；拍照和分析一体完成，流程简化。

3.应用

3.1 比率NIR-II荧光成像策略用于实时定量跟踪和可视化体内过继NK细胞的活性^[4]

自然杀伤细胞(NK)免疫治疗的疗效与移植NK细胞的存活密切相关。福州大学宋继彬教授研究团队开发了一种比率NIR-II荧光成像策略，以实时定量跟踪和可视化体内过继NK细胞的活性。该纳米探针由包覆有IR786_S的镧系下转换纳米粒子(DCNP)组成。在细胞死亡时，随着IR786s的降解，NK细胞内产生过量的ROS，在808 nm激发下打开DCNP在1550 nm处的NIR-II荧光信号，而在980 nm激发下DCNP在1550 nm处的荧光信号稳定。这种细胞内ROS诱导的比率NIR-II荧光信号被证实与体内NK细胞的活性有很好的相关性。

过继性NK细胞输注可能会受到肿瘤组织中各种物理或化学因素的影响，如缺氧、饥饿和氧化应激。NK细胞在低氧(1%O₂)、饥饿(PBS)、H₂O₂(300mM)、NaOCl(500 mM)和高温(60℃)等有害条件下培养，以模拟上述体内条件。如CLSM图像所示，在经过这些有害的处理后，观察到细胞内过量的ROS产生（ROS可以DCFH-DA探针发生反应产生亮绿色荧光），这表明当遇到有毒因素时，NK细胞可能发生细胞内氧化还原失衡。

3.2 NBOF@SOR-P-FA纳米载体体系将化疗和放射治疗相结合用于肝癌治疗^[5]

索拉非尼(sorafenib，SOR)是一种治疗晚期肝癌的多激酶抑制剂，由于缺乏选择性和明显的耐药性，其治疗效果有限。上海理工大学李钰皓副教授研究团队利用铋基介孔纳米材料(NBOF)负载SOR，然后用聚乙二醇和叶酸偶联物(P-FA)包覆，形成了NBOF@SOR-P-FA纳米载体体系。该系统通过将化疗和放射治疗相结合，实现了显著增强的抗癌效果，为肝癌的治疗提供了一种创新的方法。

当细胞与NBOF@SOR-P-FA (40 ug/mL)共同孵育时，SMCC-7721和BEL-7402细胞的存活率分别为77.2±3.2%和48.3±4.4%。当细胞用NBOF-P-FA（37.5ug/mL）处理后暴露在X-射线下时，SMCC-7721和BEL-7402细胞的存活率分别为27.1±1.7%和36.0±6.1%。此外，当细胞与NBOF@SOR-P-FA（40 ug/mL）一起孵育后用X射线照射，细胞的存活率分别下降到16.2±3.1%和18.3±4.1%（图A）。结果显示，使用NBOF@SOR-P-FA的联合化疗和放疗疗法优于其他对照组。

随后，用活/死细胞染色检测各处理组的细胞凋亡，细胞与Calcein AM和PI共染色用以观察，活细胞和死亡细胞分别被绿色和红色荧光染色。如图B所示，NBOF@SOR-P-FA+X射线组细胞死亡比例高于其他六组细胞。上述结果表明，NBOF@SOR-P-FA的协同放化疗通过促进更多的细胞凋亡而显著提高了治疗效率。

参考文献：

[1]Hosseini S M, Abdouss M, Mazinani S, et al. Modified nanofiber containing chitosan and graphene oxide-magnetite nanoparticles as effective materials for smart wound dressing. Composites Part B: Engineering, 2022, 231: 109557.

[2]Nasab S H, Amani A, Ebrahimi H A, et al. Design and preparation of a new multi-targeted drug delivery system using multifunctional nanoparticles for co-delivery of siRNA and paclitaxel. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2021, 11(2): 163-173.

[3]Wang Y, Niu N, Huang Y, et al. Three‐Pronged Attack by Hybrid Nanoplatform Involving MXenes, Upconversion Nanoparticle and Aggregation‐Induced Emission Photosensitizer for Potent Cancer Theranostics. Small Methods, 2022: 2200393.

[4]Liao N, Su L, Zheng Y, et al. In vivo tracking of cell viability for adoptive natural killer cell‐based immunotherapy by ratiometric NIR‐II fluorescence imaging. Angewandte Chemie, 2021, 133(38): 21056-21064.

[5]Zhang G C, Liu J, Yu X N, et al. Bismuth‐Based Mesoporous Nanoball Carrying Sorafenib for Computed Tomography Imaging and Synergetic Chemoradiotherapy of Hepatocellular Carcinoma. Advanced Healthcare Materials, 2020, 9(21): 2000650.

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