Transwell实验——原理、步骤、注意事项、示例图

一、实验目的

1. 测定细胞的迁移能力

2. 测定细胞的侵袭能力

3. 对细胞迁移和侵袭能力有影响作用的药物药效评价

二、背景介绍

肿瘤转移是癌症进展中一个复杂而关键的过程，在此过程中癌细胞从原发肿瘤扩散到身体的其他部位，形成继发性肿瘤或转移瘤，这一系列过程统称为侵袭-转移级联。原发肿瘤的转移过程可分为几个关键步骤(图1)：

①局部侵袭(Local Invasion)附近细胞的细胞外基质(ECM)和基质细胞层。转移的第一步是肿瘤细胞对局部附近组织的侵袭。原发肿瘤细胞外蛋白酶如机制金属蛋白酶(MMP)的分泌，可降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，从而使肿瘤细胞穿透周围组织进入循环系统。

②内渗(Intravasation)进入淋巴管或血管腔。局部侵袭后，部分癌细胞进入附近的血管或淋巴管。 这个过程称为内渗。这些血管和淋巴管为癌细胞提供了一种传播到体内远处部位的途径。

③生存于循环系统(Survival in the circulation)进入血液或淋巴系统的癌细胞面临着重大挑战，包括剪切力、免疫监视和失巢凋亡(细胞从ECM脱离时发生的一种细胞死亡)。为了在循环系统中生存，癌细胞可能会形成聚集体或团块并逃避免疫检测，这些细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells(CTCs))。

④到达解剖学上的远端器官组织。一旦肿瘤细胞进入循环，这些细胞就会被携带到全身。 最终，它们可能会滞留在毛细血管床上，其中较小的血管限制了它们的运动。 这种停滞是由于癌细胞上的粘附分子与次要部位血管内皮细胞之间的相互作用所致。

⑤外渗(Extravasation)入远端正常器官组织细胞。癌细胞必须离开血流或淋巴管才能形成继发性肿瘤。  癌细胞的粘附特性发生变化，通过穿透将血管腔与间质微环境分离的内皮细胞和周细胞层，从血管腔内进入组织，这一过程被称为外渗。

⑥在新环境中的最初生存和微转移。一旦癌细胞成功外渗，它们就会面临在其在远端组织微环境中生存的挑战。这些包括逃避免疫反应、适应新的微环境以及增殖形成继发性肿瘤。 继发部位的微环境可能与原发肿瘤不同，这些微环境的差异可能包括基质细胞的类型、ECM成分、可用的生长因子和细胞因子，甚至是组织本身的微结构。癌细胞需要适应这些变化才能生存和生长。

⑦转移性定植(Metastatic Colonization)即重新启动增殖程序并形成转移灶。经历过这七个步骤后原发性肿瘤可以产生宏观的、临床可检测到的肿瘤生长，通常称为转移定植。为了促进其生长，转移性癌细胞通常通过称为血管生成的过程诱导新血管的形成。 这确保了营养物质和氧气的持续供应，以支持继发性肿瘤的发展。继发性肿瘤可以继续侵入周围组织，并可能通过血流或淋巴系统进一步扩散。 这个过程会导致体内不同部位形成多个继发性肿瘤[1-3]。

图1 肿瘤细胞体内转移过程 

Valastyan S, Cell. 2011;147(2):275-292. doi:10.1016/j.cell.2011.09.024

三、Transwell实验原理简介

Transwell实验，也称为Transwell迁移或侵袭测定，是一种用于细胞生物学和分子生物学的实验室技术，用于研究细胞通过多孔膜的运动。它通常用于研究细胞对各种刺激(如生长因子、趋化因子或细胞外基质成分)的迁移、趋化性和侵袭[4]。Transwell实验对于评估细胞通过多孔屏障迁移或侵袭的能力特别有用，多孔屏障模拟细胞必须穿过体内组织的生理条件。Transwell实验涉及Transwell小室(插入物)和孔板，它们是一种由分隔两个隔室的渗透膜组成的装置。 通常，顶部室充满细胞，而底部室包含化学引诱剂或诱导细胞迁移的物质。多孔膜允许细胞通过膜上的小孔从顶部室迁移到底部室。

Transwell实验根据是否在小室内添加基质胶分为两种类型(图2)：

迁移测定(未在小室内添加基质胶)：在这种类型的测定中，细胞从顶部室迁移到底部室，但不需要降解或侵入膜。 这种类型的测定测量细胞响应化学引诱剂梯度而移动的能力。

侵袭测定(需在小室内添加基质胶)：在侵袭测定中，细胞不仅通过多孔膜迁移，还需要通过通常涂覆在膜顶部的细胞外基质(ECM)层降解或侵袭。例如，侵袭测定通常用于研究肿瘤细胞的侵袭行为。

Transwell实验是体外研究细胞行为的重要工具，可以深入了解各种生物过程，包括癌症转移、免疫细胞迁移和组织发育。通过计算小室底部或培养液内迁移或入侵的细胞数量，或通过测量各种细胞参数(例如细胞运动和趋化反应)的变化来量化细胞行为。

图2 Transwell实验原理 

Justus CR, Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359. doi:10.1007/978-1-0716-3052-5_22

四、仪器耗材和试剂

1. 仪器耗材：HUVEC细胞、细胞计数仪、台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、移液枪、移液管移液器、4℃和-20℃冰箱、24孔培养板、Transwell小室、培养皿、棉球或棉花、碎冰。

2. 试剂：细胞适配培养基、FBS、PBS、DMSO、P/S、胰酶、基质胶、4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液。

五、实验步骤

DAY 1(步骤1-2为实验前的准备)

1. 观察细胞生长状态，取生长状态良好的细胞去培养基，加入无血清培养基饥饿24h。

2. 将基质胶置于冰种并在4℃过夜融化，将移液管或枪头放入4℃预冷过夜。

DAY 2(步骤3-8为包被基质胶，步骤9-13为样本准备和细胞接种)

3. 使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。

4. 在冰上，将基质胶用无血清培养基稀释至1mg/mL，使用预冷的吸头混合至均匀状态。

5. 取60µL上述混合溶液垂直加入Transwell小室中，使其均匀平铺在底部，注意均匀铺胶，不要产生气泡。随后置于37℃孵育1-3小时。
6. 小心吸出未结合的基质胶。

7. 加入100µL不含血清的培养液，将培养板置于37℃培养箱孵育30分钟，进行水化。
8. 去除小室中液体，检查是否有液体穿过小室进入到下室中，若没有，则可用于接种细胞。
9. 用无血清培养基配制样本，建议将工作液浓度设置成终浓度的2倍。随后按样本：细胞悬液=1:1的比例加入到小室内。

10. 取500µl含10% FBS的完全培养基加入24孔板下室，用镊子将Transwell小室置于24孔板内。

11. 消化饥饿后的细胞，用无血清的培养基重悬，根据上室细胞接种数量调整细胞密度。

12. 先加入100uL的样本工作液，再加入100uL的细胞悬液，此时样本浓度被稀释2倍即为终浓度。

13. 将24孔板置于37℃，5%CO2，90%湿度条件下培养24-48小时。

DAY3/4(步骤14-19为细胞固定、染色)
14. 取出Transwell小室，去除培养液，用PBS浸湿的棉签或棉花轻轻擦拭小室内基质胶和细胞。
15. 在24孔板干净的孔中加入600µl 4%多聚甲醛固定液，将小室放入固定30分钟。
16. 弃固定液，PBS洗涤小室内外1次。
17. 在24孔板干净的孔中加入600uL结晶紫染色液，将小室放入染色10分钟。
18. 取出小室，PBS洗涤小室内外3次。
19. 适当风干后，显微镜下观察定性研究；取3-5个视野拍照后用ImageJ计数取平均值进行定量研究。

结果示例图：

图3 两种腺癌细胞系和其各自FL亚型细胞系的Transwell迁移和侵袭能力测定

Nakano T, PLoS One. 2017;12(8):e0181342. Published 2017 Aug 7. doi:10.1371/journal.pone.0181342

图4 HUVEC细胞不同处理条件下的Transwell迁移实验结果 Wang CG, Acta Pharmacol Sin. 2022;43(6):1617-1618. doi:10.1038/s41401-021-00777-3

图5 Transwell实验显示miR-623抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭 Li Q, Liu J, Aging(Albany NY). 2020;12(11):10246-10258. doi:10.18632/aging.103182

图6 笔者自做两次Transwell实验的结果图 样本有不同程度的抑制细胞侵袭的作用

六、注意事项

1. 基质胶在室温下溶剂凝固，铺胶过程全程需要在冰上操作。

2. 基质胶浓度也是影响细胞迁移和侵袭的因素之一，所以基质胶的浓度和稀释比例需根据供应商提供的信息和实验具体情况调整，必要时可设置预实验摸索最佳浓度和稀释比例。一般常用浓度为1mg/mL。

3. 铺胶时，尽量垂直小室底部在小室底部中间加入，可避免气泡的产生。

4. 吸出小室内未结合的基质胶时需确保移液管的尖端不会刮伤凝胶层表面。

5. 不同细胞的迁移和侵袭能力不同，可设置一系列细胞密度梯度摸索合适的细胞接种密度。
6. 小室的放置过程经常有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失，因此需特别留心。一旦出现气泡，需将小室提起或用枪头去除，去除气泡后重新放置。

7. 接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。但有时会观察到有极小的汽包产生，但并不影响细胞迁移和侵袭，也可轻轻敲击孔板去除。

8. 用PBS清洗小室时，需避物理触碰小室底部。可以准备几个无菌烧杯或培养皿，倒入适量PBS，依次涮洗，可提高效率。

9. 拍照前需适当晾干小室，水分会影响镜下视野。

七、参考文献

[1] Valastyan S, Weinberg RA. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 2011;147(2):275-292. doi:10.1016/j.cell.2011.09.024

[2] Steeg PS. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat Med. 2006;12(8):895-904. doi:10.1038/nm1469

[3] Wan L, Pantel K, Kang Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat Med. 2013;19(11):1450-1464. doi:10.1038/nm.3391

[4] Justus CR, Marie MA, Sanderlin EJ, Yang LV. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359. doi:10.1007/978-1-0716-3052-5_22

[5] Nakano T, Kanai Y, Amano Y, et al. Establishment of highly metastatic KRAS mutant lung cancer cell sublines in long-term three-dimensional low attachment cultures. PLoS One. 2017;12(8):e0181342. Published 2017 Aug 7. doi:10.1371/journal.pone.0181342

[6] Wang CG, Lou YT, Tong MJ, et al. Author Correction: Asperosaponin VI promotes angiogenesis and accelerates wound healing in rats via up-regulating HIF-1α/VEGF signaling. Acta Pharmacol Sin. 2022;43(6):1617-1618. doi:10.1038/s41401-021-00777-3

[7] Li Q, Liu J, Jia Y, Li T, Zhang M. miR-623 suppresses cell proliferation, migration and invasion through direct inhibition of XRCC5 in breast cancer. Aging(Albany NY). 2020;12(11):10246-10258. doi:10.18632/aging.103182

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