circRNA的ceRNA分子网络构建思路

具有完整闭环结构的环状RNA（circRNA）最初在1976年被鉴定。然而，由于传统RNA检测方法的限制，这些没有poly-A尾的RNA分子长期被忽略。近年来，随着高通量测序技术的发展，在真核转录组中发现了大量的circRNA 分子。由于circRNA具备高度组织表达特异性和跨物种保守的特点，目前已成为RNA分子家族中一颗耀眼的明星，目前越来越多的研究证据表明circRNAs在人类癌症和其他各类疾病中发挥重要作用。

结合circRNA高通量测序数据和现有的相关数据库可以对实验模型中circRNA分子网络进行数据深度挖掘，为后续实验验证提供可靠的实验依据和新思路，本文主要从ceRNA分子网络理论出发，解析circRNA的一般数据分析流程和研究思路。

竞争性内源性RNA（ceRNA）一般指的是可海绵样吸附miRNA的转录物如mRNA、lncRNA、circRNA等分子，这些RNA分子通过与共享miRNA的竞争性结合在转录后水平上相互调节。最近，circRNA被证明具有丰富的保守miRNA反应元件（MREs），已成为ceRNA家族的新热点。关于circRNA吸附miRNA研究报道已占circRNAs发表文献的半壁江山。如circRNA经典分子ciRs7，生物信息预测发现ciRs7上存在非常多的miR-7结合位点，后续实验也证明环状RNA ciRs7竞争性吸附miR-7后，释放了miR-7下游一系列靶基因，在多种人类癌症中发挥重要作用。但circRNA数量众多（circbank数据库目前已收录人类circRNAs达到14万多种），还有许多未知circRNA仍需探索。

CircRNA分子的ceRNA网络分析主要从以下几个方面进行：

1、获取实验模型相关的RNA分子表达谱

CircRNA表达谱的数据可以从多个来源获取，除了自己对实验样本进行高通量测序或芯片检测外，还可以通过GEO，TCGA等公共数据库下载已有研究的高通量数据。在收集好需要的circRNA高通量原始数据后，最主要的目的就是获得实验分组间差异表达的circRNA分子，这里应用最广泛的就是R语言中的各种基因差异表达分析软件包，如edgeR和DESeq2两个软件最为主流。展示circRNA分子表达情况的统计分析图主要有热图、火山图和circos圈图等。

 

 

图注：胃癌中circRNA表达谱热图（基于GEO数据分析）PMID: 30419346。

PS:

GEO数据库：GEO（Gene Expression Omnibus），即基因表达数据库，美国国立卫生研究院NCBI于2000年创建的公共数据库，具有强大的灵活性和开放性，用户可以提交、储存、检索和下载多种形式的数据。GEO数据库是目前最大、最全面的公共基因表达数据资源。

TCGA数据库：肿瘤基因组图谱（TCGA）计划是由美国National Cancer Institute（NCI）和National Human Genome Research Institute（NHGRI）于2006年联合启动的项目，研究的癌症类型从最开始的多形性成胶质细胞瘤（GBM）到现在为止共有39种，涉及29种癌症器官，1万多个肿瘤样本，27万多份文件。

LncRNA，mRNA和miRNA分子表达谱的获取，同理，也可以通过实验或挖掘数据库获得。目前去核糖体的转录组测序，构建一次文库测序后即可分析得到circRNA，lncRNA和mRNA的表达谱，从时间和经济上来说非常划算，如果想得到miRNA的表达谱，只需要用同一份样本进行miRNA测序即可，这样就可以通过生物信息学分析构建ceRNA调控网络。当然如果手头经费有限，可以考虑利用GEO或TCGA这样的高通量数据库进行数据重分析，挖掘有价值的新分子或通路。如果研究模型是肿瘤，TCGA数据库绝对是数据挖掘的绝佳对象，TCGA对29种癌症进行了几乎全大规模转录组测序，包括lncRNA，miRNA和mRNA表达谱，还有基因甲基化测序相关的数据，样本多达1万多个，绝对是肿瘤分子生物学研究的金矿。

2、miRNA结合位点预测

ceRNA的核心理论就是基于miRNA可以靶向结合mRNA，circRNA和lncRNA等RNA分子，因此miRNA结合位点的预测也是关键的步骤，miRNA靶基因结合位点预测目前已有很多算法和数据库，主要分为两类，一类是单纯算法预测，常用的算法有targetscan，miRanda和RNAhybird等，第二类是一些数据库收集了文献报道的有实验证据的miRNA靶基因关系（主要集中在miRNA靶向mRNA的数据），如Tarbase数据库等。上述两类方法也可以综合起来一起进行分析合并。

PS

miRanda

miRanda是最早的一个利用生物信息学对miRNA靶基因进行预测的软件, 由Enright等人于2003年设计开发. 作为最早的miRNA靶基因预测软件, miRanda对3′UTR的筛选依据主要是从序列匹配、miRNA与mRNA双链的热稳定性以及靶位点的保守性三个方面进行分析。

TargetScan

   TargetScan和TargetScanS.  TargetScan是Lewis等人[15]在2003年开发的一款用于预测哺乳动物miRNA靶基因的软件, 该软件将RNA间相互作用的热力学模型与序列比对分析相结合, 预测不同物种间保守的miRNA结合位点。

RNAhybrid

RNAhybrid是Rehmsmeier等 人在2004年开发的一种基于分析miRNA和靶基因间形成双链的二级结构, 从而预测miRNA靶基因的软件。RNAhybrid的算法禁止分子内、miRNA 分子间及靶基因间形成二聚体, 根据miRNA和靶基因间结合自由能探测最佳的靶位点。

 

Circbank数据库对约14万种circRNA进行了miRNA结合位点预测（运用了miRanda和RNAhybird两种算法），网站提供了友好的检索查询界面，针对每个circRNA以表格的形式列举出对应的miRNA分子。

 

图注：circbank数据库预测hsa_circTP53_001可结合的miRNAs信息表

3、ceRNA网络构建

第3步就是构建circRNA，lncRNA，mRNA和miRNA分子网络，包括核心子网络提取和图形展示，这里主要用的到工具是cytoscape，cytoscape软件有丰富的插件，可以方便地从大型分子调控网络中找到核心节点子网络，图形展示上定制程度高，可以根据研究需要，将多种信息展现在网络上，如差异表达的分子用不同的颜色标记，连接线粗细表示关系强弱等。另外cytoscape中的一些插件，如BinGO可以进行gene ontology基因富集分析，CluePedia可以对pathway信号通路可视化操作等，cytoscape已经逐渐发展为分子网络的综合分析平台。

 

图注：circRNA_100290分子网络调控展示（PMID: 28368401）