当骨折发生时，需要手术固定促进愈合，传统的钢板和螺钉固定骨折的方法虽安全耐用，但存在异物反应，无菌性松动等问题。基于水凝胶的骨黏合剂有望彻底改变现有骨损伤的临床治疗方法。然而，目前的产品仍然存在许多问题，包括细胞毒性，力学强度差以及在湿润的生物环境中固定性能差等问题。骨具有层级结构和精确的无机-有机界面，是一种不断进行自我修复以维持其承重特征的动态组织。来自福州大学的杨黄浩教授团队与宋继斌教授团队设计了一种新型的无机-有机骨黏合剂，可在体内湿润环境下进行骨折固定并加速骨再生。
单宁酸（TA）是一种来源丰富的多酚类物质，可诱导丝素（SF）与羟基磷灰石（HA）分子排列，组装成具有分级结构的有机-无机杂化水凝胶（SF@TA@HA）（图1A）。由于富含苯酚基团（模仿贻贝黏附机制），SF@TA@HA对底物表现出很强的黏附力，与基体间的界面部位存在明显的裂纹和剥离滞后（图1B）。此外，SF@TA@HA具有可塑性，可以被重新改造成各种形状，以满足不同应用场景的需要（图1C）。天然骨中的单个胶原原纤维是通过胶丝粘在一起的，当受力时，这些胶原丝会被拉伸以抵抗矿化胶原纤维的分离（图1D）。通过SEM图可以在断裂面观察到纳米尺度的长丝（图1E）。
Figure 1. Design of an adhesive hydrogel for bone fracture repair. A) Schematic of SF@TA@HA fabrication. B) Peeling process of SF@TA@HA on the substrate surface. C) The shapeable and moldable behaviors of SF@TA@HA. D) Schematic of mineralized collagen fibrils interconnected by glue filaments in bone. E) SEM image of SF@TA@HA showing the presence of filaments between the neighboring fractured surfaces. F) Rheological behavior of SF@TA@HA after repeated application of high and low strain conditions (100% strain and 0.1% strain).
胶黏剂分子是影响骨骼力学性能的关键因素，当受到外力时，胶黏剂分子可以在分子水平上增加断裂阻力。SF@TA@HA具有与胶黏剂分子类似的结构，可提高水凝胶的力学性能。研究者通过原子力显微镜测定了水凝胶的界面力，从图中可以看出SF@TA@HA呈现出了典型的锯齿形的力-距离曲线，这与天然骨类似，而聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）与磷酸钙骨水泥（CPC）没有出现类似的曲线（图2A）。并且在断裂过程中SF@TA@HA的能量耗散明显大于PMMA与CPC。水凝胶的典型应力-应变曲线如图2B所示，虽然SF@TA@HA（0.22 MPa）的拉伸强度低于PMMA（4.91MPa），但SF@TA@HA的断裂伸长率（260%）显著高于PMMA（10%）和CPC（12%），表明SF@TA@HA具有较好的韧性。SF与TA之间的交联，SF的β构象转变以及TA与HA之间的金属-酚配位键使得SF@TA@HA具有良好的韧性（图2C）。
Figure 2. Mechanical properties of SF@TA@HA at the macro/nanoscale. A) Representative AFM force-distance curves of SF@TA@HA, PMMA, and CPC, respectively. Bar charts showing the quantified values of the dissipated energy during the separation process. B) Representative tensile strain-stress curves of SF@TA@HA, PMMA, and CPC, respectively. Bar charts showing the quantified toughness. C) Schematic illustration of the proposed mechanism for achieving the high toughness of SF@TA@HA.
骨组织的主要的成分是HA与胶原蛋白，SF@TA@HA中的酚类物质具有与骨组织很强的结合力。为了测试黏合效果，研究人员将新鲜猪骨制备为破裂的组织，证实SF@TA@HA可使两块骨骼连接起来，并在切口处具有较好的黏合性能（图3A, B）。研究者进一步在体外评估了有血液存在的情况下水凝胶的黏合性能，结果表明黏合强度为607.18 kPa，仅比湿骨下降34%（图3C）。而PMMA与CPC的黏合强度分别为112.08 kPa和21.23 kPa。并且研究者发现，SF@TA@HA在湿润环境中使用时不会引起温度升高或热量产生（图3D），在水中不会坍塌，可在30天内保持稳定（图3E）。
Figure 3. Fixation characteristics of SF@TA@HA in wet environments. A) Photographs of in vitro adhesion function of SF@TA@HA by using fresh porcine bones as ruptured tissues. B) Adhesion kinetics of SF@TA@HA to porcine bones.C) Comparison of adhesion strength of SF@TA@HA versus PMMA and CPC placed on porcine bones with exposure to water or blood. D) Comparison of temperature rise and heat generation caused by SF@TA@HA and PMMA in water. E) Comparison of collapse resistance of SF@TA@HA and CPC in water.
研究人员通过大鼠的皮下移植实验来评估SF@TA@HA在体内的生物降解性和生物相容性（图4）。第45天时，SF@TA@HA的重量降解率和体积降解率分别达到了77.5%和70.6%（图4B, C）。H&E染色显示，SF@TA@HA的降解可促进自体细胞的生长和新组织的形成（图4D）。通过巨噬细胞的免疫荧光染色被用来表征局部免疫反应（图4E）。第15天的染色显示，CD68+巨噬细胞入侵组织与材料的界面，然而30天之后未观察到CD68+巨噬细胞，这说明在水凝胶植入早期会出现轻微的炎症反应，而早期的低水平炎症是组织愈合过程中的积极因素。
Figure 4. In vivo biocompatibility and biodegradation of SF@TA@HA. Schematic of a rat subcutaneous model. B) Photographs of SF@TA@HA before and after subcutaneous implantation. C) In vivo degradation ratios of SF@TA@HA based on the weight and volume loss. D) Histology images of SF@TA@HA with the surrounding tissues stained with H&E after 15, 30, and 45 d of implantation. E) Fluorescent immunohistological staining of SF@TA@HA with the surrounding tissues after 15, 30, and 45 d of implantation.
为了检测SF@TA@HA在体内修复断裂骨组织的能力，研究者以大鼠股骨骨折模型，对其固定刚度进行了评估（图5）。体内固定8周后，SF@TA@HA处理的大鼠股骨表现出与正常非骨折大鼠股骨相似的抗折强度，而未经SF@TA@HA处理的骨折后的大鼠股骨（未修复组）在相同机械载荷下会发生断裂和持续的继发性脱位。三点弯曲试验结果表明，未修复组的大鼠股骨的极限抗压强度仅为10.65 MPa，远低于正常值（36.09 MPa），SF@TA@HA处理组可以达到22.28 MPa。以上结果表明，SF@TA@HA作为骨黏合剂具有良好前景。
Figure 5. In vivo evaluation of SF@TA@HA fixation after 8 weeks implantation. A) Schematic of SF@TA@HA fixation in a rat femur fracture model. B) Images of rat femurs under the three-point bending test. Normal group: the normal rat femur. Unrepaired group: the cracked rat femur without fixation treatment. SF@TA@HA group: the cracked rat femur treated by SF@TA@HA. C) Load versus distance curves of the normal group, unrepaired group and SF@TA@HA group in the three-point bending test.
研究人员也对SF@TA@HA的骨再生能力进行了检测。与纯SF处理组相比较，SF@TA@HA在14天的碱性磷酸酶（ALP）表达明显提高，而负载骨形成蛋白-2（BMP-2）的SF@TA@HA水凝胶的ALP表达最高。钙沉积结果与ALP结果类似。随后，研究者将SF@TA@HA植入大鼠股骨缺损中考察实际修复效果。术后8周的Micro-CT结果显示，SF@TA@HA组比其他组有更多的新骨形成。
Figure 6. Bone regenerative capacity of SF@TA@HA. A) In vitro osteogenic differentiation of rat bone MSCs seeded on SF@TA@HA with or without BMP-2. ALP, von Kossa, and alizarin red staining were used to characterize the osteogenic differentiation of MSCs. ALP activity and contents of calcium deposition were also measured. B) In vivo assessment of bone regeneration in the rat femoral defect model. Micro-CT images included the analysis of axial and radial bone distribution in the defect sites after an 8-week implantation. BV and BMD were determined by Micro-CT.
本研究由来自福州大学的杨黄浩教授团队与宋继斌教授团队完成，并于2019年11月20日在线发表于Advanced Functional Materials。
论文信息：Shumeng Bai, Xueliang Zhang, Xueli Lv, Mengya Zhang, Xiaowei Huang, Yu Shi, Chunhua Lu, Jibin Song,* Huanghao Yang*. Bioinspired mineral-organic bone adhesives for stable fracture fixation and accelerated bone regeneration. Adv Funct Mater 2019, DOI: 10.1002/adfm.201908381.
供稿：丁路光
审校：韩凤选
编辑：魏强
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