Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒使用方法

钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，分别对活细胞和死细胞染色，可同时使用，对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM 的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管 Calcein-AM 本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM 能脱去 AM 基，产生的 Calcein 能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)，因此 Calcein-AM 仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的 PI 不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm，发射: 617 nm)。由于 Calcein 和PI-DNA都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用 545 nm 激发，仅可观察到死细胞。

Biogradetech Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒：

中文名称：Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒

英文名字：Calcein-AM/PI, Live/Dead Cell Double Staining Kit

Biogradetech货号：B-CHK103-500T

规格：500T

保存建议：Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒保存：-20℃干燥避光 有效期一年。

Calcein-AM/PI，活细胞/死细胞双染试剂盒使用方法：

以 HeLa 细胞染色为例，请注意不同的细胞种类、不同浓度，有不同的观察条件。

1. 染色工作液的配制

添加 2.5 µl Calcein-AM 储备液（4mM）和 12.5 µl PI（2mM）储备液至 5 ml PBS 中配制成染色溶液。Calcein-AM的终浓度为 2 µM，PI 的终浓度为 5 µM。

注意：由于 Calcein-AM 的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

2. 细胞染色

1) 染色 HeLa 细胞等贴壁细胞时，先用 Trypsin-EDTA 等消化细胞，制备成细胞悬液。

2) 将细胞悬液离心 3 分钟 (1,000 rpm)。

3) 去除上清液，加入 PBS 缓冲液，细胞数量调整至 1×105-1×106个/ml。再用移液器充分混匀。

4) 由于培养基中的血清等成分含有酯酶，Calcein-AM 会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS 洗涤数次直到完全洗净。

5) 将 200 µl 细胞悬液移至小试管中，加入 100 µl 染色溶液，在 37℃下孵育 15 分钟。

6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。

7) 在荧光显微镜下，先用 490±10 nm 波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。