学会这几点，轻松掌握神经元操控之化学遗传学技术

化学遗传学（Chemogenetics）技术作为与光遗传学类似的技术，其发生发展早于光遗传学技术，自1991年Strader 设计了一个突变β2-adrenaline受体开始，至2007年Armbruster 和Roth开发出只由特定药物激活的受体DREADDs后，化学遗传学技术被广泛的应用在了神经研究领域（图1）。其基于遗传学原理，利用化学小分子工具实现对目的细胞兴奋或抑制的调控。

图1. 化学遗传学发展进程

技术原理

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）是神经元中最大的一类信号转导分子，决定了下游效应系统的起始。GPCRs对神经元活性具有激发、抑制或其它调节作用。因此通过遗传学手段对GPCRs改造，使其能被特异性的小分子化学药物结合而对内源配体不敏感，当小分子化学药物与改造后的GPCRs结合后会激活其下游信号通路，进而导致细胞兴奋或抑制（图2）。因此化学遗传学技术主要由三部分组成：化学遗传学受体、化学遗传学受体表达递送、诱导药物。

图2. 化学遗传学作用原理

化学遗传学受体

自1991年Strader设计了一个突变β2-adrenaline,受体，其不能识别内源的adrenaline,但可以被L-185870激活，证实了化学遗传学技术的可行性。接着在1998年，Coward开发了一系列编辑的受体，称为RASSLs。最初的RASSL是对 opium 受体的改造，使其对内源的多肽配体不敏感，但能够被 opium 受体激动剂强烈的激活。之后更多的RASSL被开发用来研究味觉编码等等（Mueller et al. 2005, Zhao et al. 2003，Conklin et al. 2008）。然而其在神经领域的应用一直被限制。2007年Armbruster 和Roth开发出了适用于神经研究的基于对GPCRs的DREADD技术平台。

通过改造得到hM1Dq、hM2Di、hM3Dq、hM4Di、hM5Dq等受体，其中hM2Di和hM4Di为抑制性受体，hM1Dq、hM3Dq、hM5Dq为兴奋性受体。在神经研究中，常用hM3Dq和hM4Di分别激活和抑制某些神经元来进行功能研究，它们作用机制如图3所示。

图3 . hM3Dq（A）和hM4Di（B）作用机制

化学遗传学受体表达递送

跟光遗传学技术一样，在应用化学遗传学技术时主要利用工具病毒来实现遗传改造受体在特定细胞中特异性地稳定表达，目前以AAV载体为主。

吉凯基因目前已开发出大量的化学遗传学AAV载体现货产品（表1），包含广谱表达的、组织特异性表达的、Cre诱导表达的以及多种荧光标签，对于有其它需求的我们还可以快速定制个性化产品，助力广大科研人员的研究工作。

当前使用化学遗传学技术的诱导药物主要是Clozapine-N-oxide（CNO），其可以通过不同方式给药（图4），通常如果要观察长期调控过程中行为变化情况，则直接在小鼠饮用水中加入CNO即可，操作简单方便。如果需要多次短暂调控，则建议通过腹腔注射的方法在需要调控时间点前半小时给小鼠CNO处理。由于CNO代谢产物为氯氮平，其是一种精神类药物，因此全身性的给予CNO可能对小鼠产生一定的副作用，且无区域特异性，所以可以通过脑立体定位注射的方式直接将CNO注入目标脑区进行调节，即减弱了副作用又实现了区域特异性调控。

图4. 化学遗传学技术中常用CNO给药方案

化学遗传学技术的应用

在应用化学遗传学技术时，其实验流程如图5所示，主要分为四步：

第一步：选择合适的化学遗传学受体；

第二步：利用工具病毒载体在细胞中表达化学遗传学受体；

第三步：给予小分子化学药物处理，激活化学遗传学受体；

第四步：记录或观察动物行为学变化，确定神经元或神经环路功能。

图5. 化学遗传学技术实验流程图

应用方向

化学遗传学技术广泛的应用于信号转导、药物开发、功能基因组学等方面的研究，在神经领域其应用主要在于神经环路功能的验证，尤其是当实验室没有光遗传学技术平台设备时，化学遗传学低门槛易操作的优点使其成为神经环路研究的优选，包括中枢内的神经环路、中枢到外周的神经环路以及特定神经环路功能的验证。

应用案例

案例1：神经环路功能验证

2019年南京医科大学朱东亚教授团队在The Journal of Neuroscience 上发表其研究成果，发现前扣带回皮层至腹侧海马的神经环路是介导条件恐惧记忆泛化的关键神经环路。在研究功能相关性时作者用了化学遗传学技术，在ACC、vHPC、dHPC脑区分别注射AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine，给予CNO处理后有效的抑制各脑区神经元的活动，表明了AAC和vHPC脑区与恐惧记忆泛化相关（图6）。

图6. 化学遗传学技术验证AAC、vHPC脑区神经元与恐惧记忆泛素化的关系（Xin-Lan Bian,et al., The Journal of Neuroscience, 2019）

案例2：特定神经元功能验证

2019年河北医科大学王升教授团队在The Journal of Neuroscience 上发表的研究成果中，给予Phox2b-Cre小鼠孤束核注射AAV2-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry，在Phox2b阳性神经元中特异性表达hM3Dq，给予CNO处理后激活孤束核区域Phox2b阳性神经元进而探究孤束核Phox2b阳性神经元在呼吸调控中的作用（图7）。

图7. 化学遗传学技术研究Phox2b阳性神经元在呼吸中的功能（Congrui Fu，et al., The Journal of Neuroscience, 2019）

最后，化学遗传学技术因具有非侵入性、作用时程长、操作简单等优势，无需埋置光纤，小鼠活动自由度不受限制，且给药方式简单效果持续时间久，为人们探究不同行为的调控神经环路提供了更便捷的技术平台。吉凯基因也将持续优化化学遗传学病毒载体，更好的服务于广大科研人员的研究工作。

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