摘要
下呼吸道感染的病原学诊断一直是临床难题，宏基因组二代测序（mNGS）的广泛应用为临床提供了一种快速、准确的病原学诊断方法。但mNGS检测结果究竟应该如何解读，特别是检测出低序列数病原体时到底有无诊断价值，一直困扰着临床医生。本文从下呼吸道感染mNGS检测出低序列数的定义、发生的原因、确定结果可靠性的方法和如何结合临床正确解读低序列数报告4个方面进行讨论，希望通过全面掌握检测知识来建立正确的临床分析思维，以提高下呼吸道感染mNGS检出低序列数病原体的诊断水平。
随着分子生物学检测技术的广泛应用，宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）已成为临床感染性疾病特别是下呼吸道感染病原微生物检测的重要手段，并得到广大临床医生的认可［1, 2, 3, 4］。但随之而来的mNGS检测问题也成为临床医生的巨大困扰。其中下呼吸道标本中检测出低序列数（low reads）病原体就是最为常见的问题之一，例如外周血或BALF中检出2条曲霉，是曲霉感染吗？BALF中检出1条结核分枝杆菌复合群，可以确诊为活动性肺结核吗？这样的检测结果究竟应该判定为感染病原体，还是定植或污染的微生物？这不仅考验分子生物学实验室的检测能力，也考验临床医生的解读与诊断水平。近年来的临床实践告诉我们，只有在充分了解mNGS检测技术的基础上，密切结合临床实际才能够破解这些让临床医生难以决策的疑难问题。因此，建立正确的临床分析思维至关重要。
一、下呼吸道标本mNGS检出低序列数病原的定义
下呼吸道标本通常包括深部痰、气管吸引物、保护性毛刷标本以及BALF等。所谓mNGS检出病原体的低序列数目前并无明确定义。临床上通常将下呼吸道标本中检出的病原微生物序列数为1~3条时判定为低序列数；但需要注意的是，此时的低序列数往往指那些难以破壁（如结核分枝杆菌）或寄生于细胞内的病原体（如衣原体），如果是下呼吸道感染常见病原体，尤其医院获得性感染常见条件致病菌（如鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等），即使检测出10~20条也可以考虑为低序列数结果。至于确切的低序列数到底应判定为多少并非问题的关键，更重要的是希望引导临床医生建立评估低序列数病原检出结果的临床分析思维，从而达到正确解读与应用的目的。
二、下呼吸道标本mNGS检出低序列数病原的可能原因
1. 标本中病原微生物载量本身较低：（1）疾病本身原因导致病原体载量较低：疾病早期或恢复期标本中病原体数量很少或已经明显减少；标本采集于应用抗菌药物之后；送检的标本未采集到感染严重的组织（少菌部位）；局部感染时标本来自病原体不易进入的部位，如脑脊液和血液。（2）采样技术导致病原体载量较低：如采样过程、保存和运输过程存在导致病原微生物（尤其RNA病原体）核酸破坏和降解的因素；或标本受到一定程度的污染（假阳性）。（3）不同标本病原体含量不一：如宿主细胞含量高的标本（脑脊液、组织），通常只检测血浆的标本（大细胞病原体如细菌和真菌，细胞内病原体如衣原体被离心至细胞层），检测到的病原体含量通常较低。
2. mNGS技术本身导致的低序列数（技术本身难以避免的问题）：mNGS检测迄今尚无统一和规范的操作流程，任何一个操作或检测环节均可影响检测结果［5, 6］。（1）难以提取核酸的病原体：如分枝杆菌（包括结核和NTM）、真菌（曲霉、隐球菌等），含有坚硬的细胞壁或有非常厚的荚膜，导致破壁困难而使核酸提取效率低下，检出的序列数较少；细胞内生长的病原体如衣原体、立克次体、东方体、柯克斯体等。此时，核酸提取性能的优劣就成为影响这些病原体检出的重要因素，导致检出的病原体序列数低，甚至漏检。（2）宿主核酸含量的影响：宿主基因核酸含量非常高的标本微生物核酸占比相应减少，导致病原体低序列检出。去宿主可以极大提高病原体检出率，但过度去宿主又会引发脆弱病原体如细菌和病毒核酸降解而使其检出敏感性降低。（3）不同测序平台的影响：基因片段读长不同，碱基读取的错误率不同，测序深度不同，都会影响病原检出的序列数。常规的高通量测序文库构建需要PCR扩增，会因扩增偏好影响病原检出敏感性；应用PCR free技术可避免扩增偏好，但又可能导致病原含量低的样本漏检或低序列检出，如脑脊液、外周血样本。（4）数据库的完整性和准确性：目前临床重要的致病真菌和寄生虫的物种数据库较为有限，其拥有的庞大基因组极易和人类基因组混淆，并可能低含量存在于临床标本中。
3. mNGS检测结果报告流程本身导致的低序列数［5, 6, 7］：实验室报告人员对标本中检出的低序列数病原是否报告给临床也会影响mNGS结果的评判。mNGS报告的出具路径基本遵循以下原则，对一份标本中检出的所有微生物首先比对试剂工程菌数据库和人体微生态菌群数据库，去除之后筛选出可能的疑似病原体，再选择数量排名靠前和属内排名靠前的病原体报告；如果是临床高度致病原（如结核分枝杆菌、丝状真菌），即使数量少也列为报告的病原体。因此，根据这些人为规定流程出具的结果报告就可能导致低序列数病原报告。理解并从报告流程角度解读低序列数检出的成因、正确地判断其价值同样非常重要。
三、如何验证病原低序列数检测结果的可靠性
临床实际工作中，当拿到一份检测出低序列数病原的mNGS报告又难以判定其意义时，不要急于做出判断，可以先对检出结果的可靠性进行验证，再结合临床进行分析。
1. 应用PCR或其他特异性检测方法验证：当临床难以确定mNGS检出的低序列数微生物的意义，又无法用临床微生物常规实验室方法验证时，可采用PCR检测加以验证［8, 9］。如BALF mNGS测出低序列数结核分枝杆菌复合群，可应用结核Xpert MTB/RIF验证；血浆cfDNA测序检测出低序列数胞内致病原（如立克次体、衣原体等），血或呼吸道标本检测出低序列数病毒，均可应用qPCR验证。其他特异性病原学检测技术也可辅助验证，如BALF mNGS检测出少量新生隐球菌，可应用外周血、脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原检测验证；BALF mNGS检测出少量曲霉，可应用BALF GM和（或）曲霉特异性IgG抗体验证；BALF mNGS报告出低序列的某些易培养细菌，可应用BALF细菌培养验证；血浆mNGS报告低序列数微生物时，可关注有无肺外其他器官的混合感染。
2. 同时检测两份不同来源的标本：当检测出的病原序列数低时，若2种不同类型呼吸道标本或1种呼吸道标本与1种非呼吸道标本同时检出同一种病原，则需考虑有临床意义。如果不一致，再结合其他因素综合分析。
3. 专项对比验证：如果检出的低序列数病原意义重大，可要求检测方提供该微生物对应的序列，直接与高质量的参考基因组比对；若条件允许，也可以自行设计专用PCR引物或一代测序等自行验证。
4. 再次送检：当综合评估后，仍然难以确认检测出的低序列数病原的意义，临床也不能排除感染性疾病的可能性，必要时可以再次采集标本送检mNGS，同时提示实验室检测时特别关注疑似的病原体。
四、如何结合临床正确解读mNGS检出低序列数病原的报告
mNGS检测结果如果不结合临床进行评估，其临床意义将大打折扣，特别需要警惕仅仅依据mNGS检测结果启动、调整、联合或停用抗菌药物治疗。
1. 结合临床标本类型与检出病原体进行解读：（1）临床标本：严格把握标本采集的无菌原则，从临床角度避免可能的污染；尽量采用可靠的下呼吸道感染送检标本，首选BALF；痰液检测结果的可靠性非常低，解读时需格外谨慎。必要时可考虑送检血液、胸腔积液和肺穿刺活检标本，虽然阳性率较低，但可靠性明显增加。（2）检出病原体：呼吸道与外界环境相通、以及开放式采集导致操作过程中除病原微生物外，还会引入来自环境的微生物，解读务必谨慎。当下呼吸道标本检出低序列数的下列病原体时考虑致病微生物的可能性大：不存在或很少存在于口腔的病原体，如嗜肺军团菌、衣原体、百日咳博德特菌、白喉棒状杆菌等；结核分枝杆菌复合群（MTBC，包括MTB、卡内蒂分枝杆菌、非洲分枝杆菌和牛分枝杆菌）；NTM（常见致病的有鸟胞内分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌等）；真菌如隐球菌属、曲霉属、毛霉目及其他丝状真菌；但如果是免疫功能严重抑制的患者，即使检测出的是低毒力病原体，仍需考虑致病微生物可能性大［10］。对于罕见病原，如鼠疫耶尔森菌、汉坦病毒、白蛉病毒、钩端螺旋体、荚膜组织胞浆菌、球孢子菌等，以及各种寄生虫，mNGS低序列检出时必须结合其他实验室检查进一步验证。
检出的低序列数病原体怀疑污染时，应提请实验室结合空白对照或阴性对照以及整个批次临床样本对该病原的检出情况进行分析。若仅该样本检出，则污染的可能性较小；若对照样本或同批次其他样本中也检出同一病原体，则污染的可能性较大。
2. 结合临床表现和感染标志物进行解读：包括感染性疾病的临床症状、体征、常规实验室检查（血常规、ESR等）、影像学改变和感染生物标志物（C反应蛋白、降钙素原等）。首先判定是否存在感染的临床证据，没有临床感染证据的mNGS结果很可能是去宿主后放大的背景菌或污染菌，或是定植的病原体，判定为致病菌的可能性非常低；反之应进一步确认其致病的可能性。
3. 结合临床微生物常规实验室检查结果解读：包括下呼吸道标本的涂片、镜检、培养结果，病原体特殊染色（特别是真菌相关的特殊染色），病原体相关抗原和抗体检测（如隐球菌荚膜多糖抗原、G试验、GM试验、曲霉特异性IgG抗体等），以及特异性qPCR检测等，必要时行组织病理学检查。
4. 综合评估与分析：mNGS检出的病原体序列数差异受众多因素影响，因此对于低序列数病原体临床意义的判断，应进行综合评估分析。对于难以判定的mNGS检测结果，建议由包括实验室技术人员、生信分析人员、临床主管医生、临床微生物专家、临床感染病专家组成的团队，结合患者的临床表现、影像学改变和其他实验室检测结果，共同商议决定；如果仍然难以确定，必要时可组织专项的多学科（MDT）讨论进行决策［6, 7］。
综上，下呼吸道感染mNGS检出低序列数病原体时需要谨慎判定其诊断价值，切忌单凭mNGS检测结果指导抗感染治疗，应通过分析标本的类型和采集的可靠性，排除检测技术因素的干扰，根据检测出病原体的种类，结合患者的临床情况，做出综合判断，必要时进行多学科讨论，以及目标性治疗，最终验证其临床意义与价值。
作者：施毅 李培；单位：南京大学医学院附属金陵医院呼吸与危重症医学科
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