多种细菌、真菌可引起呼吸道感染性疾病[1]，上图中，黑色字体表示的是社区获得性肺炎常见的病原体，红色字体表示的是医院获得性肺炎常见的病原体。 而病原体不明[2]，导致诊断难、用药难。新英格兰杂志：尽管越来越多微生物和分子诊断检测用于临床，但半数CAP病例病原体仍无法确定[3-4]，部分不恰当抗菌药物使用对患者和社会产生影响。 因此，病原体「变化万千」，明确病原学诊断对所有医师尤其感染领域研究者至关重要。 最新的下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识介绍，以及目前临床对mNGS检测普遍存在的看法…… 病原宏基因组检测（mNGS）是一项突破性分子诊断技术。mNGS：无需预设，无需培养，无偏好性，直接提取临床样本中的DNA/RNA，进行高通量测序，经过专用病原数据库比对与生信分析，一次性完成细菌，真菌，病毒和寄生虫等病原体的检测[5-10]。 对mNGS（宏基因组二代测序）的价值无需作过多介绍，大家有目共睹，比如对新冠病毒感染病原学的明确，mNGS可谓立了首功。 近年来大家对分子生物学已非常熟悉，但临床应用mNGS后又会发现存在诸多问题。比如认识mNGS之初，可能大家十分兴奋，普遍认为mNGS真好，终于能够随时找到过去从未找到的感染的病原体，但麻烦也逐渐显现：早期应用后困惑——为何那么明显的感染却检测不出病原菌？「白板」结果是真的阴性吗？检测出那么多病原体究竟哪个是致病菌？还不如只检测出一种；目前存在的疑问——mNGS没有太大作用，到底应该何时、如何应用？ 目前由中华医学会呼吸病学分会发布的最新的下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识，通信作者为曹彬教授、瞿介明教授，发表在《中华结核和呼吸杂志》2023年4月第46卷第4期。 我们首先了解一下该共识的目的：确定标准和规范，促进mNGS合理用于下呼吸道感染（LRTI）临床实践，并指导开展临床研究获得一批高质量的循证医学证据；通过mNGS临床应用经验的不断积累，使mNGS检测流程标准化、检测方法同质化、数据解读生物信息库标准化；为感染性疾病的诊断提供更加专业的指导。 该共识具有以下几个特点： 目前这份专家共识比较切合临床实际。但如果出现了一个非常低的病原体序列数，它到底是或不是致病菌？如何理解？我仍希望通过反复强调，让大家认识到临床医生对mNGS报告的解读必须从两个角度（方面）来分析、解决困惑。第一是从技术角度，第二是从临床角度。 绝大数临床医生拿到报告只看有什么病原体？Reads数多少？这是容易解读错的最重要原因之一……解读mNGS报告通晓检测技术是基础 以上这些问题均为目前临床医生对mNGS报告解读的困惑点，集中在技术解读和临床解读两个方面。大家对从技术角度来解读mNGS报告有些忽略，首先，通晓检测技术是解读mNGS报告的基础。 面对病原宏基因组测序mNGS，明确作为临床医生到底应该关注什么？现在绝大部分临床医生拿到mNGS报告只看两个：第一，有什么病原体？第二，Reads数是多少？其余什么都不看，这就是容易解读错误的最重要原因之一。 要懂mNGS技术的基本原理是什么，比如mNGS检测的基本操作过程。目前许多临床医生缺乏mNGS检测的基本知识，我归纳成以下几点供大家参考： 第一，标本不同，处理不同。 血标本通常不做破壁处理，直接提取病原体DNA；血液标本中人源背景的DNA 过多，破壁会影响结果。 注意：血标本结果解读应考虑未破壁对结核、真菌、细胞内病原体检测结果的影响。 第二，要求不同，检测不同。 常规mNGS检测通常仅检测DNA病原体；而呼吸道感染的病毒多为RNA病毒。 注意：高度怀疑呼吸道病毒感染时，应同时送检RNA病原体。 第三，感染不同，标本不同。 不同部位感染，要求采集的标本不同；应尽量采集接近感染部位的标本，如呼吸道感染的支气管肺泡灌洗液（BALF）。 注意：当感染局部标本难以采集，可采集血标本；必要时采集不同来源的两份标本。 第四，抗菌与否，敏感不同。 通常认为mNGS的敏感性非常高，应用抗菌药物对检测结果没有影响。 注意：尽可能在应用抗菌药物之前采集标本，或采用数据加强版技术降低假阴性。 比较一下图左所列红色与深蓝色柱形图，红色表示外周血做出来的mNGS，深蓝色表示肺泡灌洗液做出来的mNGS；再看图右所列红色与浅蓝色柱形图，红色依然表示外周血做出来的mNGS，浅蓝色表示脑脊液做出来的mNGS。均可发现，外周血检测出来的阳性率一定低很多，因为它不破壁就有许多病原体无法找到。针对病灶送检标本的重要性——不入血或外周血病原体含量过低。 如何在众多的原始数据中给出临床真正需要的病原体信息？……不同类型呼吸道标本与测序策略的选择 要分清不同类型呼吸道标本与测序策略的选择，首先了解关于mNGS结果解读：标本类型——包括BALF及痰液样本、鼻咽或口咽拭子。要注意采样时尽量以感染病灶相关样本为准；样本采集尽可能避免污染，采样专用器材取样，采样后应及时送检。测序策略的选择——临床上的呼吸道感染如怀疑是病毒感染则建议同时进行DNA和RNA测序，以覆盖包括RNA病毒在内的全部微生物谱；考虑如结核分枝杆菌、布鲁氏菌等胞内菌，需针对性加强DNA类型宏基因组策略；已经接受广谱抗菌药物治疗的，应考虑数据量加强版的宏基因组策略，降低假阴性。 再谈谈关于技术解读。我们经常看到：1份检测报告告诉我们查到了4个病原体，可是你知道这份标本基因公司在检测的时候检到了多少病原微生物吗？最少556种，多的话可超1000种，思考一下，凭什么mNGS只告诉我们4个？因此一定要知道，mNGS出报告一定遵循了一些原则，它对病原体分类，建立了多种数据库。 将一份标本里检测出的微生物分成三大类：第一大类叫试剂工程菌，即操作过程中有的，这部分没有用，一定要把它去掉；第二大类是从感染部位取得的人体微生态菌群，这部分多数没有用，要把它去掉，仅有少数数量异常增加的微生态菌群需要考虑。我们主要关心的是最后可能感染患者的那一部分，即第三大类——疑似病原体。 技术解读大致流程图 因此，当所有的菌测出来，一定是遵循这三个流程，将所有检测到的成百上千种微生物与试剂工程菌的数据对比后去掉，再与人体微生态菌群对比后去掉，剩下的那几个才有可能是致病微生物。 再看病原体筛选的基本原则： 1.致病病原体：不能遗漏，检出即报； 如结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、鹦鹉热衣原体等临床高度关注的强致病性病原体，检出即报出。 2.人体微生态：合理报出，合理分析； 需根据样本类型、患者基础病情、免疫状态、采样方式等信息进行合理分析，区分定植与致病非常关键。 3.背景微生物：仔细甄别，严格剔除。 定期监测实验室微生物，严格剔除实验室环境菌和试剂工程菌，院内环境菌是指采样过程中带入或者患者长期暴露于医院感染的院感菌，这一部分监测到需要结合医院的实际情况综合判别。 但要注意，最后认为可能是致病微生物的还是有一大堆，怎么办呢？就将它们分成几大类，每一大类挑前面几个报给你。因此我们思考，这都是人为操作的，会不会出错？一定会出错。 以外院给我的一个病例举例：血液病患者，治疗后发烧，送检mNGS可见，有病毒、细菌，没有真菌，可患者同时送检的分泌物，连镜检、培养都看到真菌了，怎么mNGS会没有检测出来呢？恰好他们在给这家检测机构送检的同时也给另外一家检测机构送了标本，从另外那家机构的报告里可见，发现很多「镰刀菌」。回头再找这家机构问为什么会查不出来呢？对方提供了一份原始数据，发现也有几千条序列数的「镰刀菌」，可是出具报告的工作人员认为这不是致病菌，因此就不报告了。 从这个例子可看出，检测机构出具报告的原则上是看：如果这是一个明确的强致病菌，报告一定会告诉你，哪怕reads数很少（如：军团菌、鹦鹉热）；但如果检出的微生物这为背景菌，通常会把它拿掉。只有那些似是而非的条件致病菌，他们才会考虑一下，哪些报给你，哪些不报给你，所以这些人为的因素影响一定导致结果的不准确。 因此要判断是感染还是定植？检出的多种疑似病原体哪个是哪个不是感染病原体？可能是混合感染吗？就一定不是感染性疾病吗？……这些都是检测技术面临的挑战。 mNGS检测技术不断发展，mNGS在感染性疾病精准诊断面临的检验困境与三大临床需求 mNGS在感染性疾病精准诊断面临的检验困境与三大临床需求： 【检验困境】： 1.病原组成复杂；临床标本种类、性状复杂，对mNGS湿实验流程要求苛刻。 病原组成复杂：存在低载量、难破壁难检病原、细胞结构脆弱的病原等； 样本类型复杂：血液、脑脊液无菌样本；呼吸道等有菌样本；组织等高宿主样本。 样本性状复杂：血性、粘稠等高宿主背景样本； 就是改进中的靶向宏基因组技术，通过多重PCR与探针捕获富集特定病原来提高灵敏度，也有可能会改变样本中微生物的丰度，增加临床对定植、条件致病菌的解读难度。 2.如何对病原实现精准定量？ 传统mNGS体现序列数，但与病原体真实含量不对等； 在提取样本核酸后，通过分子标签实现的mNGS定量技术，忽略了样本前处理，细胞结构差异和微生物基因组GC含量、对定量带来的影响，不是真正的病原定量技术。 3.mNGS辅助进行耐药基因检测仍存在技术壁垒。 耐药基因 ≠ 耐药表型； 临床需求一：如何最大程度兼容临床样本类型和性状的复杂性，提高病原检测能力；报告解读准确的重要性远大于一味的提高灵敏度。 临床需求二：精准定量病原含量。 临床需求三：能否做到病原+药敏一步到位，辅助精准诊疗。 相关机构也意识到，要改变这种局面，mNGS检测技术必须不断发展，只做宏基因二代测序有可能固步自封。 因此开始出现定量mNGS、靶向mNGS、联检的mNGS，血的检测也不仅只做血浆了，开始做全血检测或血浆联合细胞层检测。 其中进展最大的当属tNGS，靶向mNGS。多家机构形成了良性竞争的关系，让定量的问题得到了很好的解决和突破。比如：要解决做出来不准确的问题，有机构用加一个分子内标（spike）的方案解决了，这样就可以识别里面的数据到底准不准；但另一个机构又提出，你的内标只是一个分子，我的内标更准，我们阳性菌做个内标，阴性菌做个内标，真菌再做个内标，就可以更准确地判断标本测完之后的数据是否准确。 所以，这几年比较多的机构开始做靶向的tNGS。因为临床最常见的病原微生物就是那100多种，能否先查这100多种？用正向扩增的方法，扩增出来以后再去做，它的灵敏度就会大大增加。虽然它的缺点会漏掉没有包括在内的病原学。比如PCR的扩增，用多重PCR来扩，扩完了再去做二代测序，这样做的好处是把它挑出来了再去测，比对的数量大大减少，速度大大加快，可以省钱，这是今后的一个方向……从图表中还可以看到各种分子诊断方法的优势与不足，可以很好地进行对比。 从各检测机构的方法可发现有许多都做得很好，比如超多重PCR+基因测序，最早开始做的某机构已公布的目标已涵盖5个领域：上感、呼吸、神经、感染、结核（TB-NTM），目前还在开发移植感染、消化道、真菌……它的好处是便宜，500元左右，最贵才1500元，如此一来被接受的程度就会大大提高。 但是，要怎么去解读它？这是个问题。 tNGS技术优势：减少污染，放大信号，捕获关键信息……tNGS检测出病原体的reads数如何解读？做好这些基本功课 在了解清楚tNGS的检测原理后，要知道tNGS检测出病原体的reads数如何解读？ 目前我们已经看到，在这方面做得有前景的机构越来越多： 比如某机构的病原微生物tNGS检测方案做了4个小panel，小呼吸、大呼吸、中枢、大感染，紧接着另一家机构也开始做tNGS检测，还有的机构甚至直接用三代测序来做……但最终发现三代测序更适合于科研，临床仍然用二代测序更合适。因此，在不断发展过程中不断发现问题，对于需要同时检测更多的病原体时，可以采用探针捕获联合基因测序的检测方法，可以同时检测3000多种病原体。 紧接着又有多个机构开始做，方法改进得越来越优化，发展越来越快，技术越来越先进。目前，ResFirstm准确性高、覆盖广、速度快，是下呼吸道感染病原快速诊断的一线选择。 我们还需要了解血流感染的分子检测现状： 外周血是最重要、最广泛、最容易获得的标本类型。目前临床现状是血培养阳性率低：临床血流感染病原不明比例约20%-30%，血培养是诊断血流感染的金标准，血培养的技术灵敏度很高，可达1-3 cfu/mL，但临床阳性率偏低（10-12%）；外周血mNGS检测进行了两种方法的改进以提高检测的敏感性。 因此突破点在于血液标本检测技术的改进。 mNGS应该建立病原体分级标准。 高等级的致病性病原体：如结核分枝杆菌、新型隐球菌、鹦鹉热衣原体等，在大部分类型样本中均可能是病原体； 中等级的条件致病菌：如念珠菌属，在外周血、脑脊液、穿刺液等无菌体液样本中可能是病原体，但在痰液、肺泡灌洗液、尿液中可能是共生菌，需结合临床特征慎重判断致病可能性； 低等级的条件致病菌：如凝固酶阴性葡萄球菌，在外周血、痰液、肺泡灌洗液、尿液等大部分样本类型中可能是共生菌，只在少数情况下如侵入操作后的脑脊液/外周血样本、感染性心内膜炎的赘生物样本中可能致病。 疑似背景微生物引起感染：在某些感染样本类型中能与低等级的条件致病菌相互转化。因mNGS技术检测感染性病原体为定性检测，不能区分是否为优势菌，故对于某些开放性样本的诊断价值应持慎重态度。 我们还知晓了，对不同标本中的不同病原体评估，应该有阈值的初步设定。综上可知，通晓检测技术，是解读mNGS报告的基础。 呼吸系统标本mNGS检测结果解读需遵循的原则……结合临床实践为解读mNGS报告的根本 根据新共识，呼吸系统标本mNGS检测结果解读需遵循以下原则： (1) 检出结果需结合临床表现、实验室检查、及胸部影像学； (2) 检出结果需结合其他传统微生物报告，并通过其他检测技术进行交叉验 证； (3) 结合检出微生物的种类、特异性序列数级、相对丰度判断其为致病菌、 定植菌还是背景菌； (4) 若单一标本无法判定是否致病微生物，有条件情况下可结合多个不同类 型标本的检测结果判断。 还要了解LRTI患者感染mNGS常用样本的比较。以及不同类型标本检出不同微生物的临床意义。 现在再提出，当mNGS检测出低序列数病原体时该如何判断？结合临床实践是解读mNGS报告的根本： 第一，严格取送样质控管理，把好感染病原诊断第一关。 这也是我们希望反复告诉大家的，先把标本取好，标本若是污染的，不管技术多好也没用。微生物界有句名言：Garbage in, garbage out（进去是垃圾，出来也是垃圾），意思是：送检低质量或不合格的垃圾标本，即使是再精准的技术最终得到的也只是一个更精准的垃圾结果。这种错误的结果，这种检验结果非但没有指导意义，而且可导致误诊误治。 第二，了解临床病原学分布（中枢神经系统感染、血流感染、呼吸道感染）。 第三，了解下呼吸道标本 mNGS 检测出低序列数病原体的定义，了解为什么会出现低序列检出？ 如何定义低序列检出？（1-3 reads？10-20 reads？）对于那些难以破壁或寄生于细胞内的病原体（如分枝杆菌属、诺卡菌属、曲霉、毛霉、隐球菌属与双相真菌等），一般1-3条即定义为低序列检出；而对于常见病原体特别是医院获得性感染常见条件致病菌（如鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等），即使检测出10-20条也可以考虑为低序列数检出。 其实确切的低序列数到底应判定为多少并非是问题的关键，更重要地是引导临床医生建立评估低序列数病原体检出结果的临床分析思维，从而达到正确解读与应用的目的。 为什么会出现低序列检出？1、标本中病原微生物的载量本身较低；2、mNGS技术本身导致的低序列数（技术本身难以避免的问题）[19]；3、mNGS检测结果报告流程本身导致的低序列数[20]。 第四，了解如何验证病原体低序列数检测结果的可靠性？ 如何验证病原体低序列数检测结果的可靠性？1、应用PCR或其他特异性检测方法验证；2、同时检测两份不同来源的标本；3、专项对比验证；4、再次送检。 此前王一民教授在报告中也反复讲到一句话：如果怀疑，一定要用PCR的方法去确认。因为这些病原体往往是那些难破壁的，PCR可以帮你下决心判断是或不是，这是第一；第二，能否用其他方法或技术来帮助确定？比如是血液标本，要怀疑在运输过程中会不会溶血？因为溶血以后，酶破坏后做出来的结果，RNA根本就查不出来，所以得看看标本；第三，刚才提到的技术问题，要知道有什么技术会出问题？报给你很少，但实际上并不少，还要知道为什么会出现低序列数？就能判断出是或不是。比如： 第一，1名患者在感染初期查或者是治疗快好了的时候查，肯定就会少； 第二，宿主血标本里的基因背景太多，做全血，血细胞里人体背景DNA太多，因此敏感性不高，一定出现低序列数，是感染也可能不会涉及到； 第三，当病原体难破壁，比如真菌、细菌就很难破壁，所以序列数也比较少，这时要小心，它也有可能是致病菌。 以上就是如何结合临床正确地解读mNGS报告。当然，我前述也讲到过，有不同平台（机构、公司）的报告，我们都要注意，甚至有必要的时候得回头去看原始数据。我曾经有一个患者，从病史上看特别像恙虫病，但报告里没有。我不相信，因此查原始数据，果然在他的原始数据里找到了恙虫病。所以，当我们从临床经验来判断，认为很像，应该回过头去看原始数据，这在我们最新的专家共识里也提到了这一点。 最新专家共识提供了mNGS结果临床解读流程，可供参考……也可多种方法帮助判断，不仅仅只看mNGS结果 最新的专家共识还还专门提供给大家一个流程，如何根据流程去判定它。除了用PCR的方法验证之外，还有一个方法就是临床是否存在感染，是什么感染？还可以用其他方法去验证。 比如怀疑真菌感染、曲霉感染，可以看看肺泡灌洗液结果（GM）是否支持。用多种方法帮助判断，而不仅仅只看二代测序结果；如果非常难判定，可同时送两个不同来源的标本，比如送呼吸道标本的同时送血标本，如果两个标本里找到了同一个病原学，它是致病菌的几率就大大增加，哪怕它的序列数比较少；比如痰标本和血标本里都找到耶氏肺孢子菌，它是致病菌的可能性就大大增加……甚至有时候面对很少见的致病菌，如果怀疑，也可用特殊的PCR方法去验证，只要找到特异的基因片段可以自己合成再去确认，但有一点要特别提醒大家，这样做出来的结果如果投稿给国际期刊杂志一定要拿到所有证据，一定要有可靠的数据来支持。 因此，为了让我们从PCR拿到更多的数据，获得更有力的证据，此次最新的专家共识除了给出临床路径，还告诉我们阳性时、阴性时如何判断？如何结合临床判断？ 一、密切结合临床进行二代测序解读判读 【阳性结果判读】： （1）若mNGS 结果阳性，且符合患者的临床表现和其他实验室检查，推荐根据 mNGS 结果指导临床决策。 （2）若mNGS结果阳性，且符合临床表现，但缺乏除 mNGS 结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证（在具有合适引物的条件下），并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证。 （3）若mNGS结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据mNGS结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。 【阴性结果判读】： 若mNGS结果阴性：①真阴性，排除感染；②假阴性，根据其他辅助检查结果（如培养结果等）高度提示感染可能，建议再次重复mNGS检测。 二、如何根据 mNGS 阴性报告作出临床决策？ 【考虑真阴性】： 患者肺内病灶并非是感染性疾病所致，弥漫性间质性改变可能为结缔组织疾病肺累及或其他弥漫性实质性肺疾病。 【考虑假阴性】： 技术原因而导致的假阴性：曲霉属、毛霉目、隐球菌属和诺卡菌属、分枝杆菌属等。 标本储存或者运输问题致样本核酸降解：流感病毒等RNA病毒。 使用的数据库不全，导致检出病原微生物序列未准确注释。 生信分析错误而致漏报致病微生物。 标本中人源核酸过高。 样本中病原微生物载量低于mNGS最低检测下限，或测序数据量太低未能覆盖到该病原微生物，例如已接受有效抗微生物药物治疗而导致病原微生物负荷显著降低而难以被检出。 采样不规范或标本类型不合适。 要注意的是，当mNGS回报阴性结果时，临床仍不能排除LRTI，临床医生应进一步详尽了解病史、发病特点及诊疗经过及治疗反应，结合影像学特点，反复送检常规病原学检查。必要时可送检不同部位标本(如BALF、血、肺组织等)进行mNGS检查，并动态评估患者对抗感染治疗的反应以协助进一步明确疾病类型。 三、mNGS 报告中出现多种病原微生物如何解读？ 推荐首先通过镜检、培养、抗原、PCR等方法确认，结合临床特征解读。 【考虑假阳性】： 标本质量不合格； 标本采集，送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染；检测过程中背景菌的质量控制不严格； 患者的职业和生活环境，基础疾病，临床特点和影像特征与检出的微生物不相符； 无法用其他微生物学方法验证； 治疗反应和疾病转归与检出的微生物不相符。 【考虑假阴性】： 误吸风险或明确误吸史的患者，出现多种常见口腔定植菌，需考虑吸入性肺炎/肺； 脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和(或)培养中检出相应的混杂菌群； CAP 患者有时会出现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染； 免疫缺陷宿主 LRTI 常发生细菌, 真菌,病毒,分枝杆菌等病原微生物的混合感染。 如何结合临床正确地解读mNGS报告？还要看有没有感染？PCT高不高？有没有临床表现？……即便查出一大堆病原学，可这个患者还生龙活虎地到处走，根本就没有感染的依据，查出来也不是。因此要注意四个方面： 1、结合临床标本类型与检出病原体进行解读。 临床标本：严格把握标本采集的无菌原则，从临床角度避免可能的污染。 下呼吸道标本类型优先级：BALF＞保护性毛刷标本，及深部痰；必要时可以考虑送检血液、胸水和肺穿刺活检标本，虽然阳性率较低，但可靠性明显增加。 检出病原体：呼吸道与外界环境相通、以及开放式采集导致操作过程中除了病原微生物之外，还会引入来自环境的微生物，解读务必谨慎。 2、结合临床表现和感染标志物进行解读。 包括感染性疾病的临床症状体征、常规实验室检查（血常规、血沉等）、影像学改变和生物标志物（CRP、PCT等）；判定是否存在感染的临床证据，没有临床感染证据的mNGS检查结果很可能为去宿主放大的背景菌，或是定植的病原体,判定为致病菌的可能性非常低。 3、结合临床微生物常规实验室检查结果解读。 结合微生物常规实验室检查，如下呼吸道标本的涂片、镜检，培养，病原体特殊染色，必要时组织病理学检查结果。 4、综合评估与分析。 mNGS 检出的病原序列数差异受众多因素影响，因此对于病原体临床意义的判断，应进行综合评估分析 建议由包括实验室技术人员、生信分析人员、临床主管医生、临床微生物专家、临床感染病专家组成的团队，结合患者的临床表现、影像学改变和其他实验室检测结果，共同商议决定；仍然难以确定时可进行MDT讨论。 最新的专家共识还专门给出参考，哪些一看就肯定是致病原，哪些一定是条件致病菌？哪些一定是污染菌？皮肤的和口腔的？……这些都可帮助我们进一步判断。总之，mNGS报告的正确解读立足于技术+临床，需要我们对技术的深入了解，对病情的正确评估，以及对结果的综合解读。 参考文献 （可上下滑动浏览） 1.Rytter H, et al. 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