PBJ | 又一植物攻克定点基因敲入技术难关

小立碗藓是最早的陆生植物之一，也是研究植物进化问题非常有价值的系统。至今，由于小立碗藓较高的同源重组率，小立碗藓的功能研究主要是通过基因敲除进行的。然而，通过同源重组替换冗余基因序列费工且耗时。此外，另一种有价值的亚效等位基因突变体也几乎没有产生过。

CRISPR/Cas9系统作为基因组编辑技术中明星成员，自问世以来一直是研究的热点领域。毁灭，往往比建设容易的多。这个道理在CRISPR/Cas9系统上同样适用。目前，应用CRISPR系统定点精确敲入DNA片段远比敲除基因要困难的多，这与DNA受损后修复机制息息相关。2016年，应用CRISPR/Cas9系统敲除基因在小立碗藓中成功应用，制造突变体，但定点基因敲入编辑却未有太多研究。寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides /ODNs)和CRISPR / Cas9组合使用是目前广泛采用的一种定点基因编辑技术，可以在开花植物中的实现基因敲入突变。但相同的策略是否能适用于小立碗藓却未有研究。

2019年8月27日，Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Transient cotransformation of CRISPR/Cas9 and oligonucleotide templates enables efficient editing of target loci in Physcomitrella patens ”的论文，该研究通过瞬时共转化CRISPR/Cas9和寡脱氧核苷酸模板成功在小立碗藓中实现对靶点基因的有效编辑。

作者通过PEG介导的原生质体转化方法将含有靶标片段的dsODNs（double stranded ODNs）或ssODNs （single stranded ODNs）与10μg Cas9质粒和10μg sgRNA载体共转化原生质体（图1a）。经过抗性筛选后，检测编辑效率。作者通过调整ODNs序列和片段大小，发现单独转化ODNs无法引起基因编辑表明CRISPR/Cas9和ODNs对于小立碗藓精确地基因编辑都是必须的；作者也进一步检测了定点多基因编辑的可行性，结果表明，尽管效率较低，但通过一个sgRNA也可以实现多位点的基因敲入；同时，作者验证了同时共转化多条sgRNA和多个dsODN模板检测可以实现在小立碗藓中进行多重基因编辑。

总之，作者发现ODN协助的 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术具有两个特征：1. dsODNs 比ssODNs的模板更高效；2. 小插入/缺失的引入似乎比复杂或更长的突变更有效。同时作者也指出，在片段敲入的同时，有时会检测到额外的点突变或者碱基缺失，表明非同源末端修复机制也可能参与其中。但是在没有全基因组分析的情况下，也不能简单地排除脱靶效应得影响。最后，作者希望将来可以利用更高保真的优化Cas蛋白或者识别基序改良现有的基因组编辑技术。

图1. ODN协助的 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑

该研究首次在小立碗藓中通过瞬时共转化CRISPR / Cas9和ODNs有效编辑靶基因序列。该方法可以在单个或多个位点引入多种不同类型的突变，这不仅可以促进多基因敲除，也为深入分析基因（尤其是生存必需基因）的基因功能提供可行性。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13238