Nature Methods | mRNA活体成像再添新工具

mRNA的成像通常来说会使用与荧光蛋白相连的方式来进行研究。例如，将绿色荧光蛋白与MS2噬菌体外壳蛋白（MS2 phage coat protein，MCP）融合成MCP-GFP，可以被募集到3'UTR区域包含24-48个连续的MS2发卡结构的mRNA之中【1】，该系统被称为MS2-MCP。MCP可以结合到MS2的发卡结构上，多个重复的MS2序列可达到放大信号的目的，从而实现在荧光显微镜下观察到单个mRNA的信号。但是，为了将未结合的荧光蛋白从细胞质中去除，会在MCP-GFP的融合蛋白中加入核定位元件，从而减少细胞质中的荧光背景，达到更好的检测mRNA信号的目的。但是这样也许会引入一些假阳性信号，因为被标记出的mRNAs含有数十个核定位序列【2】。

 

为了提供更好的mRNA监测工具，2019年8月31日，康奈尔大学的Samie R. Jaffrey课题组（第一作者为Jiahui Wu博士）在Nature Methods发文题为Live imaging of mRNA using RNA-stabilized fluorogenic proteins，将RNA调控的条件性发光的荧光蛋白（Fluorogenic protein）引入mRNA的成像过程。

RNA荧光适配子是能够结合在非荧光的分子上将其变成荧光形式的RNA适配子。当这些荧光染料应用在细胞里面的时候，荧光适配子标记的RNA可以通过荧光显微镜检测到【3】。但目前发展出来的荧光适配子的数量还很少，因为很少有荧光适配子能够适用于活细胞成像之中。目前大多数的染料都会被细胞内的脂质或者是DNA激活而产生非特异性的荧光【4】。为了扩展以荧光适配子为基础的细胞活体成像以及解决MS2-MCP系统带来的问题，Jaffrey课题组希望寻找到可被遗传编码的新型荧光染料。大部分情况下的荧光蛋白都是组成性表达的，会从一开始就会在细胞中保持表达，作者们想要将这种组成性表达的荧光蛋白转化成为条件性表达的蛋白，因此将设计思路定为找到除了被特异的RNA适配子结合其他多余的蛋白将会被降解的mRNA监测系统。

 

为了找到这种RNA调节的蛋白，首先作者们需要解决的问题是找到能够调节蛋白降解的“不稳定结构域”，同时这种降解能够被RNA适配子的结合所抑制。作者们设计了具有这种双重功能的肽段“tDeg”，一方面是具有降解子序列，另一方面是包含精氨酸富集的RNA结合肽段Tat【5,6】（图1）。tDeg使得蛋白不稳定的特性在环状TAR RNA存在的情况下会被废除。tDeg单独表达在HEK293T细胞中时，几乎检测不到荧光信号。而将环状TAR variant-2 RNA与tDeg一起转入细胞中时荧光强度比对照组RNA的加入要高出38倍之多。并且由于在荧光RNA适配子中不包含任何的细胞转运元件，MS2-MCP系统带来的潜在问题将不复存在。沿用之前大家对于RNA适配子使用多彩蔬菜进行命名的方式，作者们将本研究中的RNA适配子称为“Pepper”。Pepper系统能够用于不同的荧光蛋白，使得该系统具有多色可选。另外也可以对具有不同亚细胞定位的mRNA具有正确指示，进一步说明了该系统实用性。

图1 Pepper-RNA调节蛋白活体成像原理示意图

 

总的来说，Jaffrey研究组的工作找到了一种能够更特异性使用RNA适配子将组成性荧光蛋白转化为条件性发光的荧光蛋白的mRNA实时监测系统。RNA适配子Pepper用以控制荧光蛋白的稳定性，未结合的荧光会被快速地降解，而结合Pepper RNA适配子的荧光蛋白则能够稳定的存在。但是，所有使用荧光蛋白的系统都需要考虑的一个问题，就是荧光蛋白成熟所需要的时间（荧光蛋白本身动力学特性）。实时监控体外培养的细胞或者是动物体内细胞中的mRNA的动态变化过程对于mRNA活体成像系统中荧光蛋白的成熟时间等动力学特点都将提出更高的要求。

值得一提的是，9月23日，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室、光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋教授课题组与朱麟勇教授课题组在Nature Biotechnology杂志上发表了Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs文章，也是开发了拟荧光蛋白Pepper（详见BioArt报道：NBT | 杨弋/朱麟勇团队开发Pepper拟荧光蛋白RNA）。

 

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41592-019-0531-7

制版人：小娴子

参考文献

1 Bertrand,E. et al. Localization of ASH1 mRNAparticles in living yeast. Molecular cell2, 437-445 (1998).

2 Tyagi, S. Imaging intracellular RNAdistribution and dynamics in living cells. Nature Methods 6, 331-338,doi:10.1038/nmeth.1321 (2009).

3 Paige, J. S., Wu, K. Y. & Jaffrey,S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science 333, 642-646,doi:10.1126/science.1207339 (2011).

4 Fam, T. K., Klymchenko, A. S. &Collot, M. Recent Advances in Fluorescent Probes for Lipid Droplets. Materials 11, doi:10.3390/ma11091768 (2018).

5 Puglisi, J. D., Chen, L., Blanchard,S. & Frankel, A. D. Solution structure of a bovine immunodeficiency virusTat-TAR peptide-RNA complex. Science 270, 1200-1203,doi:10.1126/science.270.5239.1200 (1995).

6 Ye, X., Kumar, R. A. & Patel, D.J. Molecular recognition in the bovine immunodeficiency virus Tat peptide-TARRNA complex. Chemistry & biology 2, 827-840 (1995).