“鄂选 1 号”山桐子组培繁育体系构建

DOI:10.12171/j.1000−1522.20210116 “鄂选 1 号”山桐子组培繁育体系构建 陈耀兵1       罗    凯1       李美东1       黄秀芳1       刘汉蓁2       王水清2       陈圣林3 (1. 硒食品营养与健康智能技术湖北省工程研究中心，湖北民族大学，湖北 恩施 445000； 2. 湖北旭舟林农科技有限公司，湖北 利川 445400；3. 中国林业产业联合会，北京 100714) 摘要:【目的】山桐子作为新近开发的木本油料树种，具有广阔的发展前景。“鄂选 1 号”山桐子作为新近认定的山桐子新 品种，具有丰产稳产、适应性强等特点，备受行业关注。高质量“鄂选 1 号”山桐子良种苗木的需求日益增加，因此亟需构 建高效的山桐子良种繁育体系，旨在满足“鄂选 1 号”山桐子在行业中的广泛运用。【方法】（1）以高产优质山桐子良种“鄂 选 1 号”为研究对象，以其新生芽为外植体试验材料，以 MS 培养基为基础培养基，在对其外植体消毒方法、不定芽诱导 培养基激素组合、不定芽增殖培养基激素组合、组培苗生根培养基激素组合优化研究的基础上，利用组织培养技术构建 山桐子组培繁育体系。（2）系统地分析了“鄂选 1 号”外植体的消毒方法及植物激素在其丛芽诱导、增殖及生根过程中的 作用。【结果】（1）75% 乙醇处理 30 s，联合 0.1% HgCl2 处理 8 min 是“鄂选 1 号”山桐子良种外植体最佳消毒方法。（2）不 定芽的诱导过程中，（1/2MS + 0.03 mg/L TDZ + 1.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA）培养基组合适合“鄂选 1 号”山桐子良种 不定芽的诱导。（3）（1/2MS + 0.2 mg/L TDZ + 2.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA）培养基组合适合“鄂选 1 号”山桐子良种 组培不定芽增殖培养。（4）（1/2MS + 0.3 mg/L NAA + 0.5 mg/L IAA）培养基组合适合山桐子良种组培苗生根诱导，在此条 件组培苗生根率达到 98%。【结论】本研究构建了“鄂选 1 号”山桐子的快速繁育体系，为“鄂选 1 号”山桐子的推广应用奠 定了基础。 关键词：山桐子“鄂选 1 号”；组织培养；繁育体系 中图分类号：S792.99       文献标志码：A       文章编号：1000−1522(2022)12−0023−09 引文格式：陈耀兵，罗凯，李美东，等. “鄂选 1 号”山桐子组培繁育体系构建 [J]. 北京林业大学学报，2022，44(12)：23−31. Chen Yaobing, Luo Kai, Li Meidong, et al. Construction of tissue culture breeding system of Idesia polycarpa “Exuan 1”[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2022, 44(12): 23−31. Construction of tissue culture breeding system of Idesia polycarpa “Exuan 1” Chen Yaobing1 Luo Kai1 Li Meidong1 Huang Xiufang1 Liu Hanzhen2 Wang Shuiqing2 Chen Shenglin3 (1. Hubei Engineering Research Center of Selenium Food Nutrition and Health Intelligent Technology, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei, China; 2. Hubei Xuzhou Forestry and Agriculture Technology Co., Ltd., Lichuan 445400, Hubei, China; 3. Chinese Forestry Industry Association, Beijing 100714, China) Abstract: [Objective] As  a  newly  developed  woody  oil  tree  species, Idesia polycarpa has  broad development  prospects. Idesia polycarpa “Exuan  1”,  as  a  newly  identified  new  variety,  has  the characteristics of high and stable yield, strong adaptability and so on. The demand for high-quality seedlings of Idesia polycarpa “Exuan 1” is increasing, so it is urgent to build an efficient breeding system to meet the wide  application  of Idesia polycarpa “Exuan  1” in  the  industry. [Method] Based  on  the  optimization  of 收稿日期: 2021−05−06   修回日期: 2021−07−06 基金项目: 湖北省科技厅农业科技成果转化资金项目（2019ABB001），恩施州科技局科技支撑计划项目（D20170040），硒食品营养与健康智 能技术湖北省工程研究中心招标项目（PT082202）。 第一作者: 陈耀兵，副教授。主要研究方向：植物繁殖、栽培。Email：[e-mail]　地址：445000 湖北省恩施市学院路 39 号湖北民 族大学。 责任作者: 陈圣林，博士，高级工程师。主要研究方向：森林培养。Email：[e-mail]　地址：100714 北京市东城区和平里东街 18 号 中国林业产业联合会。 本刊网址: http://j.bjfu.edu.cn；http://journal.bjfu.edu.cn 第 44 卷 第 12 期 北    京    林    业    大    学    学    报 Vol. 44，No. 12 2022 年 12 月 JOURNAL  OF  BEIJING  FORESTRY  UNIVERSITY Dec.，2022 explant  disinfection  method,  hormone  combination  of  adventitious  bud  induction  medium,  hormone combination of adventitious bud proliferation medium and hormone combination of tissue culture seedling rooting  medium,  tissue  culture  technology  was  used  to  construct  a  tissue  culture  and  breeding  system  of Idesia polycarpa “Exuan 1”. In this study, we systematically studied the disinfection methods of the explants of Idesia polycarpa “Exuan  1” and  the  effects  of  plant  hormones  on  the  process  of  bud  induction, proliferation and rooting. [Result] (1) Using 75% ethanol treatment for 30 s combined with 0.1% HgCl2 treatment  for  8  min  was  the  best  disinfection  method  for  the  explants  of Idesia polycarpa “Exuan  1”. (2) 1/2MS + 0.03 mg/L TDZ + 1.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA medium combination was suitable for adventitious bud induction of Idesia polycarpa “Exuan 1”. (3) The combination of 1/2MS + 0.2 mg/L TDZ + 2.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA medium was suitable for adventitious bud proliferation of tissue culture of Idesia polycarpa “Exuan 1”. (4) The combination of 1/2MS + 0.3 mg/L NAA + 0.5 mg/L IAA medium was  suitable  for  rooting  induction  of  tissue  culture  seedlings  of Idesia polycarpa “Exuan  1”.  Under  this condition, the rooting rate of tissue culture seedlings reached 98%. [Conclusion] In this study, we construct a rapid propagation system of Idesia polycarpa “Exuan 1”, which lays a foundation for the popularization and application as well as further research on Idesia polycarpa “Exuan 1” at the molecular level. Key words: Idesia polycarpa “Exuan 1”; tissue culture; breeding system 山桐子（Idesia polycarpa）用途广泛，其树木可做 景观树[1]、生态防护树[2]；其果实所含油脂可作为工 业润滑油[3]、生物柴油[4]以及可食用油；其不饱和脂 肪酸含量较高，种子油中的亚油酸含量为 78.6% [5]， 精炼后的山桐子油中亚油酸含量为 52.5% ~ 81.4% [6]， 对高血脂、动脉粥样硬化等病症有一定的治疗作用[5]； 因而发展山桐子产业具有十分广阔的市场前景和良 好的经济价值[7]。 植物组织培养繁育技术可以突破外界环境及传 统繁殖技术难生根等系列限制因素，在保持品种优 良特性的基础上缩短育种周期，降低生产成本，达到 提高成苗率以及提供高标准种苗的目的[8]。山桐子 种子在自然条件下发芽率极低，即便通过人工去蜡 后，其种子的发芽率也不高，严重制约了山桐子苗木 繁育[9]，因此研究山桐子无性繁殖技术成为山桐子领 域研究的重点。祝志勇等[10]开展了山桐子硬枝扦 插、嫩枝扦插等无性繁殖试验，发现其生根率不高， 难以达到大规模推广运用水平。蒋泽平等[11]以山桐 子茎段为外植体，开展了山桐子组织培养繁育体系 的构建研究，发现移栽 30 d 后山桐子组培苗的成活 率达到了 85% 以上。杨恩让等[12]以山桐子种子和叶 片为外植体，构建了山桐子高频组织培养再生体系， 培养 40 d 后山桐子组培苗生根率达到了 88%。沈羊 城[13]以当年生山桐子山桐子茎段、叶片等为外植体 开展了山桐子离体快繁研究，山桐子组培苗生根率 为 94.4%，炼苗成活率达到了 65.85%。 山桐子树为雌雄异株，在自然条件下，雌雄比例 接近 1∶1，雄株不结果，雌株结果率差异较大[14]，在 国家已经将山桐子油列为普通食品的背景下，这一 现象将严重影响山桐子产业的发展以及山桐子油的 生产。湖北旭舟林农科技有限公司通过多年调查研 究和山桐子优良品种的选育，获得了优良山桐子品 种“鄂选 1 号”（Idesia polycarpa “Exuan  1”）品种认 定，该品种单穗质量 207.5 g，果实含油率 33.4%，其 中亚油酸含量 63.9%，7 年生单株产果量 22.5 kg，丰 产稳产，适应性强[15]，为山桐子产业的发展提供了良 好的种质资源条件。为快速推进“鄂选 1 号”山桐子 种质资源的推广，本课题组开展了“鄂选 1 号”山桐 子组织培养研究，进而通过植物组织培养无性繁殖 技术建立雌性山桐子组培苗的快速繁殖体系，为山 桐子产业的顺利推进提供试验基础。此外，本课题 的研究结果也为木本植物的组织培养理论研究提供 了一定的技术和理论基础。 1   材料与方法 1.1 试验材料 选取湖北旭舟林农科技有限公司利川市沙溪乡 大坪示范园区优质“鄂选 1 号”雌性山桐子作为山桐 子组培外植体来源，选择优质条件为：树形呈伞状， 节间距离短、挂果率高且单果较大。选择优质“鄂选 1 号”雌性山桐子新生芽顶芽及侧芽为组织培养外植 体原料。 1.2 试验方法 1.2.1    外植体消毒 对采摘的山桐子外植体进行挑选，选择新生芽 顶芽，去其叶片，将其表面清洗干净后放置于流动水 下冲洗 2 h，在超净工作台上先使用 75% 乙醇对山 桐子外植体消毒一定时间，无菌水清洗 3 ~ 5 次，无  24 北    京    林    业    大    学    学    报 第 44 卷     菌滤纸吸干茎段表面多余水分；再使用 0.1% HgCl2 对山桐子外植体消毒一定时间，无菌水清洗 3 次后 用无菌滤纸吸干茎段表面多余水分，剪去外植体暴 露于消毒液的剪口面备用，75% 乙醇和 0.1% HgCl2 不同消毒时间处理组合如表 1 所示。 1.2.2    山桐子丛芽诱导培养基选择 在前期试验的基础上，以 1/2MS 培养基为基础 培养基，选取 3 种（TDZ，6-BA，NAA）在丛芽诱导中 最为有效的植物生长调节剂，进行三因素三水平随 机 试 验 ， 质 量 浓 度 分 别 为 0.01、 0.03、 0.05  mg/L TDZ，1.0、1.5、2.0 mg/L 6-BA，0.05、0.10、0.15 mg/L NAA，每瓶 1 苗，每组 10 瓶。观察并记录丛生芽个 数、茎节长度、株高及新生芽生长情况等。 1.2.3    山桐子增殖培养基选择 以 1/2MS 培 养 基 为 基 础 培 养 基 ， 选 取 3 种 （TDZ，6-BA，NAA）在丛芽诱导中最为有效的植物 生长调节剂，进行三因素三水平随机试验，质量浓度 分别为 0.2、0.3、0.4 mg/L TDZ，1.0、1.5、2.0 mg/L 6- BA， 0.05、 0.10、 0.15  mg/L  NAA，每瓶 4 苗 ，每组 10 瓶。观察并记录不定芽株增殖情况。 1.2.4    山桐子生根培养基选择 以 1/2MS 培 养 基 为 基 础 培 养 基 ， 选 取 3 种 （NAA，IBA，IAA）在丛芽诱导中最为有效的植物生 长调节剂，进行三因素三水平随机试验，质量浓度分 别为 0.1、0.3、0.5 mg/L NAA，0、0.3、0.5 mg/L IBA， 0、0.3、0.5 mg/L IAA，每瓶 4 苗，每组 10 瓶。观察并 记录不定芽株高、叶数、根长、生根率等。 1.2.5    山桐子组培苗炼苗及移栽 当山桐子组培苗在培养瓶中每株生根数达到 5、根长达到 1.5 cm 时，开始进行组培苗炼苗。山桐 子组培苗炼苗条件主要考虑炼苗温度、湿度、开盖时 间以及炼苗整体时间。 1.2.6    山桐子组培培养条件 以上除炼苗有单独的培养条件外，其余试验所 用的培养条件为 ：温度（25  ±  2） ℃，湿度 50% ~ 70%，光照强度 2 000 lx，光照时间 14 h/d。 1.3 数据分析 采用 Microsoft Excel 2013 对试验数据进行数据 统计。相关计算公式如下： 污染率 = 污染外植体数/总外植体数×100% (1) 成活率 = 成活外植体数/总外植体数×100% (2) 诱导率 = 丛芽生长外植体数/总外植体数×100% (3) 生根率 = 生根外植体数/总外植体数×100% (4) 2   结果与分析 2.1 消毒处理对山桐子外植体灭菌效果 山桐子外植体在不同时间的 75% 乙醇和 0.1% HgCl2 的处理下，结果如表 1 所示。2 种不同灭菌处 理对山桐子外植体成活情况均具有显著性差异（P < 0.05），其中，在 75% 乙醇 30 s 和 0.1% HgCl2 8 min 的消毒情况下，外植体污染率降至 10% 左右，成活 率可达到 80%，因此山桐子外植体的最适合消毒方 法为 75% 乙醇 30 s 和 0.1% HgCl2 8 min。 2.2 丛芽诱导培养基的选择 在山桐子外植体进行诱导分化时，7 ~ 10 d 后大 部分外植体开始生长，顶芽生长较为明显，同时可以 表 1  不同消毒处理对山桐子外植体灭菌效果的影响 Tab. 1 Effects of different disinfection treatments on sterilization of Idesia polycarpa explants 75%乙醇消毒时间 75% ethanol disinfection time/s 0.1% HgCl2消毒时间 0.1% HgCl2 disinfection time/min 数量 Number 污染率 Pollution rate/% 成活率 Survival rate/% 死亡率 Mortality/% 20 4 30 67.50g 20.50a 12.00b 20 6 30 57.50f 29.50c 13.00b 20 8 30 51.75f 34.75d 13.50b 20 10 30 46.00e 34.25d 19.75d 25 4 30 62.75g 25.50b 11.75b 25 6 30 53.50f 33.00d 13.50b 25 8 30 42.50e 40.50e 17.00c 25 10 30 34.00d 39.75e 22.25e 30 4 30 32.50d 52.75f 14.75b 30 6 30 23.75c 62.75g 13.50b 30 8 30 10.25b 84.50h 5.25a 30 10 30 3.50a 23.25b 73.25f 注：同列数据后不同小写字母的表示差异显著（P < 0.05）。Note: data in the same column with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05). 第 12 期 陈耀兵等： “鄂选 1 号”山桐子组培繁育体系构建 25 观察到整个茎段逐渐长粗，且在接近培养基处的叶 柄逐渐脱落，在之后的 25 ~ 30 d 内，侧芽逐渐开始 生长。山桐子外植体在不同激素组合的培养基上的 生长统计情况如表 2 所示，部分组合丛芽生长情况 如图 1 所示。综合分析丛芽的数量和长势，最终选择 1/2MS + 0.03 mg/L TDZ + 1.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L 表 2  不同质量浓度生长激素对山桐子外植体丛芽诱导的影响 Tab. 2 Effects of different mass concentrations of growth hormone on cluster bud induction of Idesia polycarpa explants 组合 Combination/（mg·L−1） 丛芽个数 Number of clump bud 生长情况 Growth condition 0.01 TDZ + 1.0 6-BA + 0.05 NAA 2 绿色，茎部未见增大，产生少量愈伤组织 Green, no enlargement of stem, and a small amount of callus is produced 0.01 TDZ + 1.0 6-BA + 0.10 NAA 3 绿色，茎部有少量增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is slightly enlarged, and a small amount of callus is produced 0.01 TDZ + 1.0 6-BA + 0.15 NAA 1 绿色，茎部有少量增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is slightly enlarged, and more calli are produced 0.03 TDZ + 1.0 6-BA + 0.05 NAA 2 绿色，茎部有明显增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a small amount of callus is produced 0.03 TDZ + 1.0 6-BA + 0.10 NAA 2 绿色，茎部有明显增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a small amount of callus is produced 0.03 TDZ + 1.0 6-BA + 0.15 NAA 3 绿色，茎部有明显增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a small amount of callus is produced 0.05 TDZ + 1.0 6-BA + 0.05 NAA 1 绿色，茎部有少量增大，未产生愈伤组织 Green, the stem is slightly enlarged, no callus is produced 0.05 TDZ + 1.0 6-BA + 0.10 NAA 1 绿色，茎部有少量增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is slightly enlarged, and a small amount of callus is produced 0.05 TDZ + 1.0 6-BA + 0.15 NAA 3 绿色，茎部有少量增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is slightly enlarged, and more calli are produced 0.01 TDZ + 1.5 6-BA + 0.05 NAA 2 绿色，茎部增大明显，产生少量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a small amount of callus is produced 0.01 TDZ + 1.5 6-BA + 0.10 NAA 2 绿色，茎部增大明显，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.01 TDZ + 1.5 6-BA + 0.15 NAA 1 绿色，茎部增大明显，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.03 TDZ + 1.5 6-BA + 0.05 NAA 6 绿色，茎部有较明显增大，有少量愈伤组织，丛芽生长良好 Green, the stem is obviously enlarged, with a small amount of callus and the cluster buds grow well 0.03 TDZ + 1.5 6-BA + 0.10 NAA 5 绿色，茎部有明显增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.03 TDZ + 1.5 6-BA + 0.15 NAA 4 绿色，茎部有明显增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.05 TDZ + 1.5 6-BA + 0.05 NAA 4 绿色，茎部有明显增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a small amount of callus is produced 0.05 TDZ + 1.5 6-BA + 0.10 NAA 3 绿色，茎部有明显增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.05 TDZ + 1.5 6-BA + 0.15 NAA 3 绿色，茎部有明显增大，产生大量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a large number of callus are produced 0.01 TDZ + 2.0 6-BA + 0.05 NAA 2 绿色，茎部有明显增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.01 TDZ + 2.0 6-BA + 0.10 NAA 2 绿色，茎部有明显增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.01 TDZ + 2.0 6-BA + 0.15 NAA 2 绿色，茎部有明显增大，产生大量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a large number of callus are produced 0.03 TDZ + 2.0 6-BA + 0.05 NAA 4 绿色，茎部有明显增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a small amount of callus is produced 0.03 TDZ + 2.0 6-BA + 0.10 NAA 7 绿色，茎部有明显增大，产生少量愈伤组织，丛芽生长良好 Green, the stem is obviously enlarged, a small amount of callus is produced and the cluster buds grow well 0.03 TDZ + 2.0 6-BA + 0.15 NAA 6 绿色，茎部有明显增大，丛芽较多，但产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and there are many clumps of buds, but more calli are produced 0.05 TDZ + 2.0 6-BA + 0.05 NAA 4 绿色，茎部有明显增大，产生少量愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and a small amount of callus is produced 0.05 TDZ + 2.0 6-BA + 0.10 NAA 4 绿色，茎部有明显增大，产生较多愈伤组织 Green, the stem is obviously enlarged, and more calli are produced 0.05 TDZ + 2.0 6-BA + 0.15 NAA 3 绿色，茎部有明显增大，产生较多愈伤组织，部分玻璃化 Green, the stem is obviously enlarged, more calli are produced, and part of them are vitrified  26 北    京    林    业    大    学    学    报 第 44 卷     NAA 作为山桐子最佳丛芽诱导培养基。 2.3 山桐子外植体增殖培养基选择 将诱导成功的山桐子外植体放置于增殖培养基 中进行继代培养。继代培养开始后，丛生芽会快速 增长，但是同时也会出现丛生芽比较纤细容易折断 以及部分玻璃化的现象。故在增殖培养中，需要根 据丛生芽的生长情况适时对其转接，3 芽以上的丛 生芽生长活力较强，转接时至少保证有 3 芽为最佳。 山桐子丛生芽在不同质量浓度组合的植物生长调节 剂的培养基中生长情况如表 3 所示，部分山桐子丛 生芽增殖培养效果见图 2。根据实际丛生芽的生长 统计结果，选择 1/2MS + 0.2 mg/L TDZ + 2.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA 作为最佳山桐子组培苗增殖 培养基。 表 3  不同质量浓度生长激素对山桐子外植体丛芽增殖的影响 Tab. 3 Effects of different mass concentrations of growth hormone on proliferation of cluster buds of Idesia polycarpa explants 组合 Combination/（mg·L−1） 丛芽增加个数 Number of cluster bud increased 生长情况 Growth situation 0.2 TDZ + 1.0 6-BA + 0.05 NAA 3 长势良好 Grow well 0.2 TDZ + 1.0 6-BA + 0.10 NAA 5 长势良好 Grow well 0.2 TDZ + 1.0 6-BA + 0.15 NAA 6 长势一般 Average growth 0.2 TDZ + 1.5 6-BA + 0.05 NAA 6 长势良好 Grow well 0.2 TDZ + 1.5 6-BA + 0.10 NAA 5 长势良好 Grow well 0.2 TDZ + 1.5 6-BA + 0.15 NAA 6 丛生苗纤细 Clustered seedlings are slender 0.2 TDZ + 2.0 6-BA + 0.05 NAA 10 长势优良 Grow excellent 0.2 TDZ + 2.0 6-BA + 0.10 NAA 8 长势良好 Grow well 0.2 TDZ + 2.0 6-BA + 0.15 NAA 6 丛生苗纤细 Clustered seedlings are slender 0.3 TDZ + 1.0 6-BA + 0.05 NAA 7 长势良好 Grow well 0.3 TDZ + 1.0 6-BA + 0.10 NAA 5 丛生苗较纤细 Clustered seedlings are slender 0.3 TDZ + 1.0 6-BA + 0.15 NAA 5 丛生苗较纤细 Clustered seedlings are slender 0.3 TDZ + 1.5 6-BA + 0.05 NAA 5 丛生苗细弱 Clustered seedlings are thin and delicate 0.3 TDZ + 1.5 6-BA + 0.10 NAA 4 丛生苗细弱 Clustered seedlings are thin and delicate 0.3 TDZ + 1.5 6-BA + 0.15 NAA 4 丛生苗纤细 Clustered seedlings are slender 0.3 TDZ + 2.0 6-BA + 0.05 NAA 6 丛生苗较纤细 Clustered seedlings are slender 0.3 TDZ + 2.0 6-BA + 0.10 NAA 7 丛生苗纤细 Clustered seedlings are slender 0.3 TDZ + 2.0 6-BA + 0.15 NAA 6 丛生苗纤细 Clustered seedlings are slender 0.4 TDZ + 1.0 6-BA + 0.05 NAA 0 部分玻璃化，未统计 Partial vitrification, not counted 0.4 TDZ + 1.0 6-BA + 0.10 NAA 0 部分玻璃化，未统计 Partial vitrification, not counted 0.4 TDZ + 1.0 6-BA + 0.15 NAA 0 部分玻璃化，未统计 Partial vitrification, not counted 0.4 TDZ + 1.5 6-BA + 0.05 NAA 0 少量玻璃化，未统计 A small amount of vitrification, not counted 0.4 TDZ + 1.5 6-BA + 0.10 NAA 0 部分玻璃化，未统计 Partial vitrification, not counted 0.4 TDZ + 1.5 6-BA + 0.15 NAA 0 玻璃化严重，未统计 Serious vitrification, not counted 0.4 TDZ + 2.0 6-BA + 0.05 NAA 0 玻璃化较严重，未统计 Serious vitrification, not counted 0.4 TDZ + 2.0 6-BA + 0.10 NAA 0 玻璃化较严重，未统计 Serious vitrification, not counted 0.4 TDZ + 2.0 6-BA + 0.15 NAA 0 玻璃化严重，未统计 Serious vitrification, not counted A B C D A. 0.01 mg/L TDZ + 1.0 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA；B. 0.05 mg/L TDZ + 1.0 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA；C. 0.05 mg/L TDZ + 1.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA；D. 0.03 mg/L TDZ + 1.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA. 图 1    不同激素组合山桐子外植体丛芽诱导生长情况 Fig. 1    Cluster bud induction growth situation of Idesia polycarpa explants under different hormone combinations 第 12 期 陈耀兵等： “鄂选 1 号”山桐子组培繁育体系构建 27 2.4 山桐子外植体不定根诱导培养基选择 理想的不定根苗应当健壮无玻璃化，苗株基部 尽可能不产生愈伤组织，根从丛生芽基部直接长出， 且细长，避免海绵状膨大的膨化根出现。不同激素 水平对山桐子组培苗不定根生长的影响结果见表 4， 部分激素组合山桐子组培苗不定根生长情况见 图 3。根据不定根根系生长情况及统计分析，最终选 择 1/2MS + 0.3 mg/L NAA + 0.5 mg/L IAA 作为山桐 子组培苗最佳生根培养基。 2.5 山桐子组培苗炼苗及田间移栽条件优化 当山桐子组培苗每株不定根根数达到至少 5、 根长达到 1.5 cm 时，对组培苗进行炼苗移栽。山桐 子组培苗炼苗成功的主要因素主要有温度、湿度、瓶 盖打开尺度及时间。经过大量试验发现：炼苗开始 时，山桐子组培苗需要自然光的照射，故对其进行半 遮阳处理，此时温度与湿度应保持与培养室相同；在 此基础上将山桐子组培苗放置于自然光下培养 10 ~ 12 d，此时温度与湿度不变；之后逐渐打开组培瓶瓶 盖，与自然环境下的空气接触，此时室温及空气湿度 分别维持在 25 ℃ 和 90%，当组培苗叶片出现蜡质 层，炼苗结束。 炼苗结束后对组培苗进行基质移栽，步骤为：从 培养瓶中取出组培苗，洗去培养基，将组培苗浸泡于 生根粉中，浸泡时间为 15 min；培养基质材料分别 为 1∶1∶1 的蛭石 + 珍珠岩 + 腐殖土、纯腐殖土以及 河沙。将灭菌后的基质转移至穴盘中进行组培苗的 移栽。将移栽组培苗后的穴盘转移至炼苗棚内，保 证充足的水分，棚内维持在温度（25 ± 2） ℃，湿度 90% 左右。当移栽组培苗基本成活后，逐步降低湿 度，实时控水，温度范围适当放宽，同时每隔 3 d 喷 洒 1 次植物疫苗农药，防止病虫害。穴盘移栽 20 d 左右，当组培苗根部新的根系长出，植株完全适应环 境，即可进行大田移栽。相关炼苗移栽效果见图 4， 通过比较发现，选用纯腐殖土作为移栽基质效果与 其他基质更好。 3   讨　　论 离体组织培养是一种生物技术，已被广泛用于 遗传改良栽培品种。在组培快繁体系构建与运用 中，选择种子、叶片、茎段作为外植体来进行无性繁 表 4    不同激素组合对山桐子组培苗生根的影响 Tab. 4    Effects of different hormone combinations on rooting of tissue culture seedlings of Idesia polycarpa 组合 Combination/（mg·L−1） 生根率 Rooting rate/% 0.1 NAA + 0.0 IBA + 0.0 IAA 52 0.1 NAA + 0.0 IBA + 0.3 IAA 61 0.1 NAA + 0.0 IBA + 0.5 IAA 68 0.1 NAA + 0.3 IBA + 0.0 IAA 71 0.1 NAA + 0.3 IBA + 0.3 IAA 55 0.1 NAA + 0.3 IBA + 0.5 IAA 62 0.1 NAA + 0.5 IBA + 0.0 IAA 74 0.1 NAA + 0.5 IBA + 0.3 IAA 65 0.1 NAA + 0.5 IBA + 0.5 IAA 72 0.3 NAA + 0.0 IBA + 0.0 IAA 89 0.3 NAA + 0.0 IBA + 0.3 IAA 84 0.3 NAA + 0.0 IBA + 0.5 IAA 98 0.3 NAA + 0.3 IBA + 0.0 IAA 89 0.3 NAA + 0.3 IBA + 0.3 IAA 85 0.3 NAA + 0.3 IBA + 0.5 IAA 78 0.3 NAA + 0.5 IBA + 0.0 IAA 95 0.3 NAA + 0.5 IBA + 0.3 IAA 81 0.3 NAA + 0.5 IBA + 0.5 IAA 57 0.5 NAA + 0.0 IBA + 0.0 IAA 42 0.5 NAA + 0.0 IBA + 0.3 IAA 71 0.5 NAA + 0.0 IBA + 0.5 IAA 74 0.5 NAA + 0.3 IBA + 0.0 IAA 58 0.5 NAA + 0.3 IBA + 0.3 IAA 46 0.5 NAA + 0.3 IBA + 0.5 IAA 49 0.5 NAA + 0.5 IBA + 0.0 IAA 56 0.5 NAA + 0.5 IBA + 0.3 IAA 51 0.5 NAA + 0.5 IBA + 0.5 IAA 45 A B C D A. 0.2 mg/L TDZ + 1.5 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA；B. 0.2 mg/L TDZ + 1.5 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA；C. 0.2 mg/L TDZ + 2.0 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA；D. 0.2 mg/L TDZ + 2.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA. 图 2    不同激素组合山桐子外植体丛芽增殖生长情况 Fig. 2    Cluster bud proliferation growth situation of Idesia polycarpa explants under different hormone combinations  28 北    京    林    业    大    学    学    报 第 44 卷     殖均有报道，其中选择茎段为外植体发育形成的再 生植株具有遗传稳定性好、变异率低等特点[16]。本 研究中采用“鄂选 1 号”雌性山桐子新生芽顶芽及侧 芽的茎段作为组织培养外植体原料，在培养基中长 势良好的，分化和增殖效果明显，褐化及污染现象 较少。 3.1 外植体消毒处理对组培体系构建的影响 在植物组织培养操作过程中，外植体消毒处理 对于培养体系成功构建十分关键。多数植物在生长 过程中伴有内生菌，通常与植物本身和谐共生，甚至 影响植株的正常生长和代谢[17−18]，同时加上环境微 生物的污染，使得外植体消毒处理十分困难，如何做 到既能够除去微生物污染，又能够保障外植体成活， 是植物组织培养的关键。在对用于体外培养的外植 体材料进行消毒时，需要考虑很多因素，包括基因 型、外植体类型、消毒程序、株龄和生理状态以及消 毒所用的试剂和时间[19]。本试验中，“鄂选 1 号”山桐 子外植体适宜使用 75% 乙醇处理 30 s 联合 0.1% HgCl2 处理 8 min 的消毒方法，结果显示 ：乙醇和 HgCl2 处理时间对外植体污染率和死亡率都有较大 的影响，其中 HgCl2 的消毒处理时间对山桐子外植 体的伤害更加明显。这与 Romadanova 等[20]的研究 结果相似，其使用 523 培养基检测苹果（Malus sp.） 品种、克隆砧木和野生离体培养中的真菌和细菌污 染情况，结果发现，外植体污染水平与体外芽的发育 或活力呈负相关，而感染水平随着暴露时间或 HgCl2 浓度的增加而降低。本试验对乙醇消毒时间和 HgCl2 消毒时间的梯度设置跨度较大，在后续的研究中可 适度设置更小时间间距进行进一步的试验研究，以 便获得更加精确的最佳消毒时间，在能够达到消毒 效果的基础上尽量减少处理时间，以便降低对外植 体的伤害。消毒试剂种类以及消毒处理时间因外植 体的种类、部位以及采前气候和预处理方式不同而 显示出差异，因此应针对外植体消毒试剂、消毒时间 进行详细的单因素实验研究，以便减少因消毒试剂 选择不当、消毒时间不宜等因素造成消毒不彻底或 者引起外植体褐化等现象产生[21]。在离体培养建立 过程中，由于损伤引起的多酚氧化，极易引起的组织 褐变的阻碍[22]。因此，减少组织褐变可以通过适时 收集外植体，在培养基中单独或联合添加抗氧化剂， 如抗坏血酸、活性炭或聚乙烯吡啶，或使用液体培养 或微嫁接等方式。 3.2 外源生长调节剂对组培体系构建的影响 外源生长调节剂对植物组培体系的构建具有显 著的影响，是组培再生植株的形态建成以及不定芽 的分化、增殖不可缺少的调节物质。本试验中运用 了 TDZ、6-BA、NAA、IAA 等生长调节剂进行山桐 子外植体分化、增殖以及生根外源激素组合筛选在 大多数植物组培体系中，植物生长调节剂的比例，特 别是 TDZ 和 6-BA，会影响芽诱导结果[23]。TDZ 对 外植体不定芽的诱导作用显著，与低浓度的其他激 素组合使用可以有效的促进不定芽的诱导[24]。但是 Castillo 等[25]发现，在持续使用 TDZ 进行苹果砧木 的组织培养时，会导致外植体和叶片变形。在本次 试验中，相对高浓度的 TDZ 不利于丛芽增殖，其丛 芽生长纤细并出现了玻璃化现象。6-BA 也是植物组 培实验中广泛运用的细胞分裂素，与一定浓度 NAA 组合使用对不定芽的诱导效果显著[26]，相比较低浓 度而言，高浓度的 NAA 导致从芽诱导过程中产生了 较多的愈伤组织，在培养过程中随着其浓度的增加， 玻璃化现象明显增加。 NAA、IBA、IAA 等外源激素在组培及扦插的生 A B C D A. 0.3 mg/L NAA + 0.3 mg/L IBA + 0.0 1mg/L IAA；B. 0.3 mg/L NAA + 0.03 mg/L IBA + 0.5 mg/L IAA；C. 0.3 mg/L NAA + 0.5 mg/L IAA；D. 0.5 mg/L NAA + 0.3 mg/L IAA. 图 3    不同激素组合山桐子组培苗生根诱导生长情况 Fig. 3    Rooting induction growth situation of tissue culture seedlings of Idesia polycarpa under different hormone combinations 图 4    山桐子组培苗炼苗、移栽示意图 Fig. 4    Acclimatization and transplants of Idesia polycarpa tissue culture seedlings 第 12 期 陈耀兵等： “鄂选 1 号”山桐子组培繁育体系构建 29 根诱导试验中广泛使用，其中 NAA 既能够促进发 芽，同时也有利于组培苗生根，而 IBA 主要用于诱 导生根[27]。在本试验中，高浓度的 IBA 不利于山桐 子组培苗的生根，这可能是由于该植物中较高浓度 的 IBA 的抑制作用；而高浓度的 IAA 促进了山桐子 组培苗的生根，这可能是高浓度的 IAA 通过快速的 细胞分裂和细胞伸长来激活根的生长，这与 Prajapati 等人的研究结果相似[28]。本试验中，NAA 与 IAA 激 素组合处理过的外植体的营养生长更好，可能是由 于根的数量和长度最大，这可能从土壤中驱动更多 的营养和水，并增强更多的光合作用，最终导致植物 生长更多。 4   结　　论 虽然对于山桐子组培快繁有部分文献报道，但 多数未达到大规模应用效果，同时部分研究采用的 是利用愈伤组织进行繁殖，其组培苗发生变异可能 性会增加，为了避免山桐子组培苗发生变异，保持其 良好性状同时实现规模化应用，本研究首次报道了 “鄂选 1 号”山桐子新品种的高效组织培养体系，对 外植体消毒时间、激素浓度进行了优化，最终建立了 高效的“鄂选 1 号”山桐子新品种组培再生体系。本 研究为“鄂选 1 号”山桐子的快速繁殖技术推广以及 山桐子组培苗的培养和工厂化育苗奠定了良好的 基础。 参 考 文 献 祝志勇, 王强, 阮晓, 等. 不同地理居群山桐子的果实含油率与 脂肪酸含量[J]. 林业科学, 2010, 46(5): 176−180. 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