文章来源：中华检验医学杂志, 2022,45(3) : 214-219
作者：谢凤欣 靳伟东 田晖艳 和海妍 府伟灵 张阳
摘要
数字PCR（dPCR）是近年迅速发展起来的一种绝对定量的技术，该技术将含有DNA模板的反应体系分配到大量独立的反应单元中进行PCR，根据泊松分布和统计阳性信号来计算DNA拷贝数。与传统的qPCR相比，dPCR不依赖于扩增曲线，不受扩增效率的影响，具有较高的准确度和重复性，可以实现绝对定量。本文综述了数字PCR发展历史以及在感染性疾病分子诊断、肿瘤液体活检、产前诊断等方面的应用进展，并展望了该技术的应用前景。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）自20世纪80年代被发明以来，已发展成为生命科学领域最基础的分子生物学实验方法。第1代PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳来分析PCR产物，仅适用于定性和半定量研究。20世纪90年代初出现了第2代PCR，即定量PCR（quantitative PCR，qPCR），qPCR技术由于其灵敏度高，操作简单，快速经济等优势，目前已广泛应用于临床实验室中［1］。然而，该技术依赖于用已知浓度的标准品来构建标准曲线，且反应体系中的大量抑制物会影响扩增效率，导致灵敏度受到限制。第3代数字PCR（digital PCR，dPCR）的出现解决了这一系列问题，可实现核酸模板的绝对定量、稀有突变检测、拷贝数变异、基因重排等检测，在分子生物检测领域有着巨大的应用前景［2］。
一、dPCR的原理与优势
1992年Sykes等［3］通过有限稀释和终点信号有无定量检测IgH重链突变基因，奠定了dPCR的发展基础。1999年Vogelstein和Kinzler［4］首次提出了dPCR的概念，为了测量大肠癌患者K-RAS突变，对样品进行有限稀释后分配到384孔板中进行反应，并成功检测到K-RAS突变。然而，此时在分配样品环节上仍需人工操作，在分配的均匀性和数量上都达不到要求，限制了dPCR技术的发展。近几年，随着微流控技术、油包水乳化微滴、纳米制造等技术的发展，使dPCR突破了技术瓶颈，各类商业化的具有高通量、自动化和廉价的dPCR技术平台得以发展，此后，dPCR被迅速引入临床工作［5］。
1.dPCR的基本原理：dPCR是基于单分子扩增和反应体系分割的一种技术，通过将样本高倍稀释以及反应体系的大量分割，使含有模板分子的反应体系分配到反应单元中，理想情况下每个反应单元中含有0或1~5个模板分子。当每个反应单元进行PCR扩增后检测其荧光信号，如果该单元包含模板分子，则PCR扩增产生阳性信号。最终处理数据时根据泊松分布的原理和荧光信号呈阳性的反应单元数来计算目的分子的拷贝数［6］。目前，根据分液方式的不同，dPCR主要分为2种：第1种微滴dPCR（droplet dPCR，ddPCR），是基于油包水乳化微滴技术，在油介质中产生水滴形成乳液，其中每个液滴作为PCR单元；第2种微流体dPCR，是基于微流控技术，将反应液均匀导入芯片上的微池或微通道中进行PCR反应，用荧光显微镜判读结果。
2.dPCR的优势：dPCR在核酸分子诊断中展现了巨大的应用潜力，主要优势有：（1）dPCR样本需求量低，当检测难以捕获的样品或存在核酸降解的样品时，dPCR仍然具有较高的准确性。（2）高灵敏度，dPCR与传统PCR的最大的不同是将1个反应单元变成了数万个反应单元，在这些反应单元中进行独立的检测，大大地提高了检测灵敏度，也避免了大量背景DNA的干扰。（3）可以绝对定量，dPCR通过终点荧光信号检测和计算阳性反应单元的比例来计算目的序列的拷贝数，可实现绝对定量检测。然而，dPCR的动态检测范围较窄，反应时间长，成本高，都是亟待解决的问题。
二、dPCR技术在感染性疾病分子诊断中的应用
一些病原体如2019新型冠状病毒、埃博拉病毒、人体免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）和结核杆菌等在感染的潜伏期，病原体在血浆中的浓度太低，无法用传统的方法如酶联免疫吸附剂测定或者血涂片来确定。因此需要高灵敏度的技术来快速准确地检测病原体。dPCR绝对定量技术在可疑病原体筛查方面具有显著优势，已经用于血清、脑脊液和组织样本的检测，其敏感性和可重复性均优于qPCR。
（一）病原微生物的鉴定与绝对定量
1. 新型冠状病毒载量分析：自2019年底以来，新型冠状病毒的全球暴发流行，已成为国际关注的公共卫生紧急情况。核酸检测是新型冠状病毒感染的重要确诊依据，qPCR检测已成为冠状病毒检测的主流方法，然而，qPCR的敏感性和可靠性存在一定的局限性，频频出现“假阴性”等负面技术问题［7］。ddPCR具有绝对定量的优点，比qPCR检测更敏感，ddPCR可通过动态监测病毒载量，在评价抗病毒药物的疗效方面发挥重要作用。Yu等［8］比较了qPCR和ddPCR对不同组织样本中病毒载量的检测。结果表明，二者在阳性样本中结果一致，qPCR的循环阈值（cycle threshold，Ct）与ddPCR的拷贝数值高度相关。然而，当Ct值在34~38时，相同Ct值的样品的病毒载量有显著性差异，表明当病毒载量较低时，qPCR的Ct值可能不能敏感地反映病毒载量水平。在4个qPCR阴性样本中，ddPCR以低病毒载量给出了阳性结果。说明在高病毒载量样品和阴性样品中，qPCR和ddPCR准确可靠，但ddPCR对低病毒载量样品的检测效果较好。
2. HIV病毒载量监测：HIV是导致人类获得性免疫缺陷综合征的慢病毒［9］。抗逆转录病毒疗法能够抑制感染患者的HIV复制，但当治疗停止时，病毒会持续复制并反弹，因此能够持续量化病毒对于治疗获得性免疫缺陷综合征非常重要。由于qPCR的灵敏度无法监测血液中稀有的HIV DNA的细微变化，而dPCR能富集低丰度HIV DNA，对监测体内HIV DNA的含量有着巨大应用前景。Strain等［10］分别用ddPCR和qPCR对150多个样本中总HIV DNA含量进行测定，95%样本为HIV患者外周血单个核细胞，其余为纯化的CD4 T细胞。结果 表明与qPCR相比，在模板拷贝数较低的情况下，ddPCR的精确度比qPCR高很多倍，说明ddPCR的应用将显著提升HIV检测的灵敏度。
3.牛结核杆菌的检测：牛结核分枝杆菌是可同时感染人类和动物的病原体，诊断的金标准一直以培养为基础，存在检出率较低、检测时间长等局限性。Tao等［11］利用dPCR仪进行微滴式数字环介导等温扩增（digital loop-mediated isothermal amplifification，dLAMP）对低浓度的牛结核分枝杆菌进行了精确定量，同时用qPCR检测并对结果进行了比较，其研究结果显示，dLAMP的检测灵敏度为14 CFU/ml，比qPCR高1个数量级（10倍）。该团队将dPCR仪用于dLAMP，建立了高灵敏度、方便、快捷的牛结核分枝杆菌定量检测方法，为食品安全检测、流行病学研究提供了强大的检测平台。
（二）病原微生物耐药基因检测
1.耐药突变位点检测：Whale等［12］同时用dPCR和qPCR来检测甲型流感病毒耐药突变的频率，发现dPCR已能检测和量化在野生型病毒背景下存在的0.1%甚至更少的罕见变异，优于qPCR5%的阈值。嗜肺军团菌是1种严重肺炎的致病因素，嗜肺军团菌氟喹诺酮耐药突变的发现可解释部分肺炎患者治疗失败的原因。由于这种病原体的挑剔性质，基于标准培养的抗生素敏感性测试方法并不适用于嗜肺军团菌。Hennebique等［13］设计了与嗜肺军团菌氟喹诺酮耐药抗性相关的3个gyrA基因突变位点248ct（T83i）、259ga（D87n）和259gc的dPCR检测方法，以便快速、准确地检测和定量呼吸道样品中的这些耐药突变体。结果显示dPCR能够检测到与野生型序列混合的gyrA突变体序列，其突变/易感等位基因比率为1∶1 000（0.1%）。
2.耐药基因拷贝数检测：有机残留物如粪便或污水常被用作农业土壤的肥料，然而通常含有抗生素耐药细菌。Cavé等［14］用qPCR和dPCR方法从土壤和残留物样品中提取细菌基因组DNA来检测抗生素耐药基因（分别编码磺胺类和喹诺酮类耐药的SUL1和QNRB基因）的拷贝数。研究结果显示qPCR具有更好的定量范围，然而在背景DNA或抑制剂的存在下，qPCR敏感性会降低，当低浓度和低拷贝数变化的情况下，或者当抑制剂对PCR效率有主要影响时，dPCR是一种更好的检测技术。
三、dPCR在肿瘤液体活检中的应用
人类恶性肿瘤有多种类型，其起源和进化与广泛的遗传改变有关［15］。目前，组织活检仍然是评估肿瘤分子特征的标准生物材料，但仍存在重复取材困难［16］、肿瘤内异质性高［17］等现实问题。液体活检是对肿瘤在体内流出物（主要是血液）中释放的许多成分的分析，包括无细胞循环核酸（DNA、mRNA、非编码RNA）、“肿瘤诱导血小板”或小泡［18］。来源于肿瘤的循环肿瘤DNA（ctDNA）已被认为是1种肿瘤生物标志物，可对肿瘤的演变进行动态监测。然而，来源于肿瘤的DNA被体内其他细胞释放的DNA所稀释，ctDNA仅占总游离DNA的0.01%，检测ctDNA需要灵敏度较高的技术，而高灵敏度的dPCR技术在检测ctDNA上具有很大的优势。
（一）ctDNA检测与肿瘤靶向治疗
靶向治疗作用于与癌症相关的特定分子靶点，目前在临床上具有非常显著的疗效。在进行靶向治疗前需要进行相关基因的检测，对于一些无法进行组织活检的患者来说，dPCR是一种非常好的检测手段。肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌类型的85%。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是肺癌的主要驱动基因，在NSCLC中常被检测到过度表达。EGFR基因突变主要发生于外显子18~21上，当EGFR基因发生19号外显子缺失或21号外显子L858R突变时，采用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI）靶向药物治疗会取得比较好的疗效［19］。然而，NSCLC患者在经过靶向治疗后会发生继发性耐药，其中50%~60%为EGFR基因T790M突变，而三代EGFR-TKI药物AZD9291对这类患者有较好的疗效。因此，NSCLC患者进行EGFR基因突变检测对于患者治疗方案的选择以及调整是非常有必要的。
目前，《NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识》中推荐可用血浆ctDNA代替肿瘤组织进行EGFR突变检测［20］。利用具有高灵敏度、绝对定量优势的dPCR技术来检测ctDNA可实现肿瘤的“液体活检”，可达到NSCLC患者的个体化精准治疗。Wang等［21］回顾性调查了135例晚期NSCLC患者，同时采用突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）和dPCR方法对这些患者EGFR-TKI治疗前后血浆中的循环游离DNA（cfDNA）进行T790M突变检测，其结果表明dPCR检测T790M突变的检出限约为0.03%，其检出率高于ARMS，更加适用于T790M突变的检测。Chen等［22］在150例接受EGFR-TKI治疗的NSCLC患者中，利用ddPCR技术量化了尿、血中的EGFR突变，并与原发性癌症组织样本做对比。其数据表明，尿ctDNA在检测EGRF突变方面与组织相比有88%的一致性，且检测灵敏度与血浆结果相当。因此，尿ctDNA可能是组织样本EGFR突变检测的潜在替代物，利用ddPCR技术来检测尿ctDNA的EGFR突变可以作为无创监测TKI治疗的有效手段。
（二）基因突变检测与治疗反应监测
癌症相关基因突变随疾病进展或治疗的进展而动态变化，因此基因突变的检测可以用来监测癌症的转移或复发。
KRAS基因的12、13号密码子的突变在结直肠癌和胰腺癌中均有较高的发现率，被认为与肿瘤的发生、复发及患者预后直接相关［23］。现有的检测KRAS突变的方法如Sanger测序测定等位基因突变的灵敏度约为20%；二代测序方法的灵敏度约为5%；ARMS-PCR方法的灵敏度在1%左右。而dPCR用于等位基因突变检测的灵敏度可以达到0.05%~0.10%，甚至更高［24］。为评估ddPCR在结直肠癌患者血浆KRASG12V突变检测中的敏感性和重现性，Olmedillas等［25］的研究表明，与健康对照比较，结直肠癌患者血浆中野生型KRAS和KRASG12V突变的拷贝数显著升高。此外，在癌症转移的情况下，突变拷贝数会更高，说明KRASG12V突变与预后相关，如进展差、术后并发症发生率高、生存期短等。因此该突变可作为监测结直肠癌疾病进展的无创生物标志物之一，利用ddPCR检测结直肠患者血浆中KRASG12V突变是可取的。
HER2蛋白很少在正常组织中表达，但它可以在乳腺癌、胃癌和其他肿瘤细胞中过度表达，其表达水平与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。HER2基因表达检测被广泛用作乳腺癌和胃癌患者靶向治疗的辅助诊断工具。目前批准用于临床的检测通常是基于蛋白质水平的免疫组织化学或基因水平的荧光原位杂交，但这些检测只能用于组织标本，无法对肿瘤细胞的HER2进行动态监测。有学者利用dPCR技术来检测血液标本中HER2基因表达状态，其结果显示血液标本HER2检测的准确性与组织标本一致性很高，说明通过dPCR检测血液中HER2表达水平是一个非常好的手段，可作为癌症治疗过程中的监测工具［26］。
四、dPCR在无创产前诊断中的应用
产前检查是预防婴儿出生缺陷的重要手段。传统的产前诊断需要通过羊水穿刺术和绒毛取样等侵入式的手段来获取检测样本，会造成一定的流产概率［27］。1997年由英国的Dennis Lo团队通过证明孕妇血浆中Y染色体序列的存在发现母体血浆中存在着胎儿游离DNA（cell free fetal DNA，cffDNA），自此无创产前诊断成为了研究热潮［28］。然而，cffDNA只占母体血浆DNA的10%~20%，且含量在妊娠周期中是不断变化的［29］，这就需要高灵敏度的分子诊断技术来捕获母体血浆中胎儿游离DNA。dPCR技术的发展为无创产前诊断提供了新的技术手段，能够精确地量化母体中含量极低的胎儿游离DNA，以达到对遗传疾病的准确检测。
脊髓性肌萎缩症是一类常染色体隐性遗传病，婴儿发病率约为1/6 000~1/10 000，中国人群的携带率约为1/42［30］。目前已知造成此症的原因主要是与位于第5条染色体上的运动神经元存活基因（survival motor neuron，SMN）关联较大。SMN1和SMN2是脊髓性肌肉萎缩的致病因素，SMN2的拷贝数可以作为诊断疾病严重程度的指标［31］。Stabley等［32］采用dPCR技术对取自脊髓性肌萎缩症患者的成纤维细胞株和永生化淋巴细胞株样品进行SMN1和SMN2基因拷贝数检测，发现dPCR可以检测到0~3拷贝的SMN1和0~5拷贝的SMN2，并对比了RT-PCR，发现检测下限要远低于RT-PCR。
21三体综合征属于染色体非整倍体疾病，新生儿发病率约为1/600。EI Khattabi等［33］利用dPCR技术对213例孕妇血浆DNA样品进行了验证研究，结果表明即使在胎儿游离DNA含量较低的情况下，dPCR技术也可以区分出21三体综合征，说明该方法可以满足临床筛查工作。
地中海贫血是由珠蛋白生成障碍导致的溶血性贫血疾病，属于单基因遗传病，在我国南方发病率较高。目前检测方法还是依赖于羊水穿刺和绒毛活检等具有风险的方式来获取胎儿基因信息，dPCR技术的发展对地中海贫血无创产前筛查提供了新思路［34］。张艺佳等［35］建立了1种ddPCR技术来检测母体血浆游离DNA中父源β地中海贫血CD41-42突变的方法，其结果表明该方法能够在目标序列浓度为5.0%~0.5%时准确检测出目标序列，其操作简单快速，适用于夫妻为非同型β-地中海贫血基因携带且父方为CD41-42突变的排除性无创产前诊断。
五、展望
近几年，随着微流控技术、油包水乳化微滴、纳米制造等技术的发展，dPCR技术得以发展。dPCR作为第3代PCR技术，在灵敏度和精确度上达到了前所未有的高度，能在复杂背景下检测到罕见突变，达到对核酸的绝对定量，为病原微生物检测、肿瘤个体化治疗、耐药性研究、产前诊断等领域提供了新的技术手段。由于dPCR的巨大应用前景，市场上已有多款商业化的dPCR仪器出现，且有国内外知名企业相继进军dPCR领域，对于dPCR技术的发展有着积极的促进作用。但是，对于dPCR在临床检验中的广泛应用仍存在限制和挑战：成本高，相较于qPCR，dPCR的仪器以及配套试剂成本较高；通量不够高，由于dPCR荧光通道的限制，对于多靶标样本的筛查需要更多的工作量；目前dPCR商业化的平台不够成熟，还未达到标准化的检测方法和数据处理方式；dPCR技术在医疗领域的应用还需要大量的临床样本验证。将来，通过dPCR技术的不断发展，以及与高通量测序、环介导等温扩增、质谱等技术的联合使用，dPCR技术会在临床分子检验中发挥更大的作用。
附：2022年继续教育单项选择题（六）
1.数字PCR（dPCR）技术是基于单分子扩增和反应体系分割的一种技术，通过将样本高倍稀释以及反应体系的大量分割，使含有模板分子的反应体系分配到反应单元中，每个反应单元中含有（）个模板分子。
A.0个 B.1个 C.2个 D.以上都对
2.以下哪一项不是微滴式dPCR的技术优势（）
A.高灵敏度、高特异性
B.真正意义上的绝对定量，可统计突变率
C.所需样本量较多
D.实验数据分析便捷
3. dPCR技术根据（）以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度和拷贝数。
A.笛卡儿定理
B.泊松分布原理
C.卡尔丹公式
D.海伦公式
4.dPCR技术是一种核酸分子绝对定量技术，能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，关于数字PCR的原理，有关叙述错误的是（）
A.dPCR反应体系需要加入一定的缓冲溶液和Mg2
B.dPCR是基于DNA单分子PCR方法进行计数的核酸定量
C.每个反应单元有无荧光取决于是否含有靶分子
D.PCR和dPCR在检测病原体的灵敏度上完全相同
5.目前，数字PCR技术的应用包含哪些（）
A.拷贝数变异分析
B.稀有突变检测
C.基因表达分析
D.以上都对
参考文献（略）
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