第一部分：基本概念和常见优化方法
1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量。
一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2. 退火：这是PCR 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。
在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的DNA 样品稀释1000-100000倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达10的9次方-10次方。
扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝Co(1 P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。
第二部分：实验室常见问题及经验分享
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。2、引物浓度不佳。适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度配比。3、镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒。4、模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染, 或操作环境中有气溶胶造成污染, 建议对操作环境进行处理, 或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。标准曲线线性关系不佳R2<0.9,很有可能是以下环节存在问题:
2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度DNA模板分装,保存于-20℃或-80℃,现配现用;3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针;4、模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求,一般模板量以50—500ng为宜。1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现; 引物浓度不佳, 尤其是涉及二聚体存在时, 适当降低引物浓度, 并注意上下游引物的浓度比例;2、模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入, 或通过引物设计避免非特异性扩增。3、离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度, 或选择更适合的mix试剂盒, 不同试剂盒在该方面的优化能力不适合, 有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果;遇到扩增曲线异常,比如“S”型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题:
3、在操作荧光定量PCR时,带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等;4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:
1、反应试剂中部分成分比例是否最佳,另外考虑荧光染料是否降解;2、反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间;3、反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再加入反应体系,减少抑制物的影响。
信息来源：实验与分析、检验视界网、Super Lab
