技术名称
Polymerase Chain Reaction，PCR
中文名称
聚合酶链式反应
原理
DNA双链复制
即在体外模拟DNA的复制过程 (DNA在生物体内的复制过程，请见
#技术原理#13 基因测序(1)--基础知识)
特点
生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可在短时间内大量扩增目的基因，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。
应用
生物医学、犯罪取证、分子考古等领域
发明人
Kary Mullis 于1983年开发
原料
DNA模板(template)：含有需要扩增的DNA片段。
2种引物(primer)：决定了需要扩增的起始和终止位置。
DNA聚合酶(polymerase)：复制需要扩增的区域。
脱氧核苷三磷酸(dNTP)：用于构造新的互补链。
含有镁离子的缓冲体系：提供适合聚合酶行使功能的化学环境。
辅助设备
热循环设备
过程
1.变性：利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。
2.退火或称接合,复性：在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃，仅需时间5~10秒。
3.延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。
优势
与微生物复制DNA的方式相比，效率更高。
微生物复制DNA是一个费时耗力的流程，首先要将DNA经限制酶剪裁，再利用连接酶（Ligase）加到运载体（Vector）中，之后利用瞬间电击（Electroporation）或是热休克（Heat Shock）的方式，送到大肠杆菌感受态细胞（competent cell）中，将此菌于培养皿大量繁殖培养，再经过繁复的分离、纯化过程，时间通常需要近一周，才能大量复制片段。
PCR 扩增流程如下图所示
PCR 扩增流程原理及过程视频介绍如下所示，来源 西班牙马德里通用有机化学研究所(IQOG-CSIC)发布的科普视频 Bilibili '生物博学堂'添加中文翻译
视频讲解
一次 PCR 检测流程总耗时
总体分三个时间段：
预变性热循环(变性 退火 延伸)PCR 反应的最后延伸和终止
(1) 预变性 时间 T0：5-10 min
进行 PCR 反应的第一步是要对反应体系进行预变性，该过程的目的是使模板 DNA 分子完全变性，同时激活热稳定的 DNA 聚合酶，具体时间建议参考所用 DNA 聚合酶的使用说明书。
(2) 热循环
变性时间 T1
退火时间 T2
延伸时间 T3
T1、T2、T3，对于不同厂家试剂、不同技术，存在一定的差异。
(3) PCR 反应的最后延伸和终止 时间 T4：5～10min
使得未完全延伸的扩增片段全部延伸完全，以提高产物的扩增效率
(4) 总耗时
一般 PCR 进行20~40个热循环周期，假定循环次数 N，则：
一次PCR检测流程总耗时 ≈ T0 N*(T1 T2 T3) T4
PCR 反应所用原料作用
引物 (Primier)
引物决定了对哪些目标核酸模板进行大量扩增。
特定的专一性引物决定了所扩增的 DNA 片段。
引物（primer）本质上是人工合成的短 DNA 片段，一般不超过 50 个碱基（通常 18－25 个），它们与所要扩增的 DNA 片段的起始和终止区域完全互补。
DNA 聚合酶 (polymerase)
引物结合于 DNA 模板的起始和终止点，DNA 聚合酶结合到引物所在位置，根据模板 DNA，使用脱氧核苷三磷酸 (dNTP) 拼装合成新的 DNA 链。
镁离子
作为辅助因子，具体机理见
#技术原理#13 基因测序(1)--基础知识。
热循环设备
热循环设备，可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子或者在反应体系表面加入一层石蜡油。
----------------------------------------------------------------
本站仅提供存储服务，所有内容均由用户发布，如发现有害或侵权内容，请
点击举报。
