作者：杨启文 倪语星 林丽开 罗燕萍
孙自镛 李敏 吴文娟 章强强 苏丹虹
喻华 康梅 徐和平 刘伟 杨青 王贺
王瑶 简翠 郭莉娜 杨文航 徐英春
近年来侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，准确、早期诊断是治疗疾病的关键。然而，目前我国临床实验室真菌检测能力离临床诊治需求尚有较大差距，亟待改进。
国家卫生计生委办公厅于2016年底发布了《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函[2016]1281号），要求在2020年以前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。本共识的制定旨在建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，从而提高综合医院真菌感染诊疗能力。
一、术语和定义
（一）酵母菌
单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，称为酵母菌（yeast）。临床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等。
（二）丝状真菌
多细胞真菌有菌丝和孢子，菌丝延长分枝，交织成团，称为丝状真菌（filamentous fungi）。又称霉菌（mold）。临床重要的丝状真菌包括曲霉菌、毛霉菌、镰刀菌等。
（三）双相型真菌
有些真菌可因环境条件（如营养、温度、氧气等）改变，由一种形态转变为另一种形态，称为双相型真菌（dimorphic fungi），如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、马尔尼菲篮状菌等。这些真菌在体内或在含动物蛋白的培养基上，37 ℃培养时呈酵母相；而在普通培养基，25 ℃培养时呈霉菌相。
二、环境和设施要求
真菌实验室环境和设施的设计应确保实验的质量和生物安全。
（一）环境要求
真菌实验室应与细菌、病毒等实验室区分，以防发生交叉污染。其面积以满足工作和安全要求为宜，合理布局。在建设实验室或开展实验活动之前，应进行生物危害评估。
（二）基本设施
设置防飞虫纱窗和门禁，有充足的照明、应急灯、通风、供水、供电、紧急疏散标识及信息系统，工作区设有洗手池、应急淋浴和洗眼装置；门外有生物安全级别标识[1]。
配置生物安全柜和不同温度培养箱（至少包括25~30 ℃以及35~37 ℃）。设置耐化学品和消毒剂腐蚀的防护用品及器材。
（三）气流要求
实验室宜设计负压或定向气流，主实验室气流应由清洁区送入操作区。生物安全柜为Ⅱ级，其高效过滤器对于直径为0.3 μm的微粒过滤效率不低于99.99%[2]。
（四）消毒措施的管理
工作台面可用5%石碳酸或0.5%过氧乙酸或含氯消毒剂（500 mg/L）消毒。如遇操作台被真菌或标本污染，应立即覆盖纸巾，并用5%石碳酸或含氯消毒液（2 000 mg/L）消毒20 min。切忌用水冲洗，以免污染扩散[3]。高压灭菌效果建议使用指示条以及生物指示剂进行监测。
（五）医疗废物的管理
真菌培养标本及污染物在丢弃前，需做好生物安全防护，废弃物的容器或包装材料应当符合防水、防破损、防外泄的要求，特别是丝状真菌，建议用医用胶布或透明胶带密封后高压灭菌[4]。
实验室废物的最终处置应交由经当地环保部门资质认定的医疗废物处理单位集中处置。
（六）丝状真菌处理的生物安全要求
丝状真菌的检测需在Ⅱ级生物安全柜内进行，特别是可疑高致病性病原真菌（荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌等），严格执行《病原微生物实验室生物安全通用准则》进行操作及处理[5]。BSL-2级临床微生物实验室不建议对高致病性真菌进行大量活菌的操作（如大量活菌的传代培养，药敏试验等）[5,6]。
三、人员要求
临床微生物实验室真菌专业组人员配置应根据开展的真菌检测项目及工作量适当配置。人员要取得检验相关上岗证，经过真菌岗位的基本培训（岗前培训、持续培训）和工作能力的评估。
培训内容至少包括：（1）生物安全，实验室设施设备安全使用，检测前、中、后的风险及突发事件的处理；（2）检测技能，所开展检测项目的基本原理、参考区间、质量控制、结果影响因素和实验室信息系统的使用等；（3）伦理和患者信息的保密等。
能力评估包括：（1）常规工作的过程和程序以及安全操作；（2）设备维护和功能检查；（3）检验结果的记录和报告过程；（4）核查工作记录和解决问题的技能等。评估方法：对新进的员工，在最初6个月内应至少进行2次能力评估，其他员工应每年进行1次能力评估，并对每位员工的评估结果进行记录，并据此授予相关检测权限。
四、仪器和试剂要求
（一）对实验室仪器和设备的要求
真菌实验室应根据各自医院的规模和诊治对象的不同需求，配备符合工作要求的仪器和设备[7]。仪器设备要求见表1。
表1 真菌实验室仪器和设备的配置要求
仪器装机后，在临床使用前，应按照说明书对各仪器的关键性能进行相应的验证和评价，如对检测准确度、精密度、可报告范围等进行验证，性能验证通过后方可用于临床检测。生物安全柜应根据使用频率定期（每年至少1次）进行安全性能检测，必要时更换高效滤膜或进行甲醛熏蒸消毒[4]。
（二）对实验室检测试剂的要求
真菌相关实验室检测试剂，应满足国家对检验试剂的相关要求，实验室应按照制造商或相关指南、规范的说明和建议储存试剂。商品化试剂或实验室自制试剂都需要在使用前严格进行性能验证，实验过程中做好质量控制。
五、检测技术要求
真菌检测技术包括形态学检查、培养、鉴定、药敏试验、免疫学检测、分子生物学检测等。直接涂片镜检简便、快速，能够在各级医院开展，经染色后镜检可更为清晰地观察其形态学特征，对临床诊断具有重要价值。合格标本（无菌部位尤其血培养的临床价值高）经培养后根据菌落大小、形态、颜色可初步判断，并进一步做鉴定和药敏试验。使用显色平板和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）可缩短检验周期，提高鉴定准确性。分子生物学检测灵敏度高，血培养的特异性强。联合抗原（隐球菌抗原、G试验、GM试验）和抗体检测等多种真菌实验室检测技术的合理应用（多次检测、联合检测），结合临床病史、症状体征及影像学检查，有助于早期诊断侵袭性真菌病。常见真菌病的微生物学诊断方法建议见表2。
表2 常见真菌病的微生物学诊断方法建议
（一）标本采集处理
各类标本的采集与处理要求如下。
1．血液：
推荐在抗真菌药物使用前，发热初期或寒战期取静脉血。采集后立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。至少采集2套。采血量与培养基比例为1/10~1/5（必须包括需氧瓶或真菌专用瓶）。2 h内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。严格执行皮肤消毒程序可有效降低血培养的污染率。双相血培养瓶（含肉汤加琼脂斜面）较单纯肉汤培养基更早发现阳性[16,17]。
2．骨髓液：
使用肝素化的注射器或溶解离心管采集骨髓液0.5 ml（儿童）至3 ml（成人）后送检。15 min内常温送检。若不能及时送检，则常温保存，已出现凝聚的标本不能送检。骨髓液真菌培养可采用裂解离心培养系统（如Isolator）或商业化的真菌自动化培养系统（如专用的真菌血培养瓶），少量骨髓可直接接种到培养基中。标本采集和接种操作需严格遵守实验室规范或商品说明书。实验室人员还需关注骨髓中大量白细胞产生CO2可能导致的培养瓶假阳性。骨髓涂片非常重要，需做吉姆萨或瑞氏染色镜检。播散性的念珠菌、隐球菌及曲霉感染都可能累及骨髓[3]。
3．无菌体液（脑脊液、心包液、腹腔积液和关节液）：
除脑脊液外，其余的无菌体液宜置于含肝素的无菌真空采血管，15 min内送检，若不能及时送检，则常温保存（不能冷藏）。部分新型隐球菌在37 ℃不生长，建议接种二管分别置25 ℃及37 ℃[16]。脑脊液可直接接种于血培养瓶，提高阳性率。也可同时作隐球菌荚膜抗原检测。
4．脓液、引流液、创面分泌物及窦道：
开放性创口，用无菌生理盐水冲洗创面后，采集病灶活动性边缘坏死组织标本及分泌物。封闭性脓肿，局部皮肤消毒后用注射器抽取脓血性液体送检。2 h内常温送检。如有颗粒应以无菌生理盐水漂洗后采集颗粒并记录颗粒的颜色，压碎后镜检及培养。标本通常可作KOH湿片、革兰或荧光染色，发现真菌菌丝或孢子具有诊断意义[16,17]。较浓稠的标本需使用消化液处理。
5．下呼吸道标本（深部痰液，支气管肺泡灌洗液）：
清洁口腔后采集晨痰，采用支气管毛刷取样和采集支气管肺泡灌洗液。推荐采集至少3份痰液标本，可以提高阳性检出率，支气管肺泡灌洗液对于非艾滋病患者检测耶氏肺孢子菌是最佳标本，对于艾滋病患者诱导痰或常规痰标本具有与支气管肺泡灌洗液相同的敏感性。唾液或24 h痰液都不推荐作真菌培养。支气管冲洗液因含较多的定植真菌也不宜作真菌培养。标本2h内室温送检，若不能及时送检，则4 ℃保存。呼吸道标本液化后离心取沉渣检测可以提高阳性率。临床怀疑组织胞浆菌和皮炎芽生菌感染时，标本建议尽快送检。
6．口腔及口咽部标本：
采用无菌生理盐水湿润的拭子轻轻刮取黏膜损害表面，作KOH或荧光染色涂片，同时种于含氯霉素的沙氏琼脂或念珠菌显色培养基。口咽部感染最常见的真菌为念珠菌。不推荐采用鼻腔拭子，可以采用鼻腔组织及鼻窦冲洗液标本。
7．眼（角膜刮片、玻璃体液等）：
一般由临床医生操作。15 min内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。角膜刮片直接接种至不含抑制剂的培养皿中，采用X或C型涂菌方式；玻璃体液离心后取沉淀物接种。眼内标本一般量较少，操作时须严格无菌，防止污染。
8．组织标本：
采集标本后用无菌容器转运，如标本量较少，应滴加几滴无菌生理盐水保湿。及时送检，若不能及时送检则室温保存。培养标本使用无菌眼科剪将标本剪成米粒大小后接种，对标本作研磨后接种可以增加标本与培养基的接触面积，同时也能使组织胞浆菌等一些胞内菌释放出来提高培养的阳性率；怀疑接合菌感染的组织则直接剪碎后接种，研磨可能会破坏菌丝降低其生长活力。组织标本可作KOH或荧光染色涂片，能及时发现真菌成分，帮助临床诊断，尤其对一些不能人工培养的真菌如鼻孢子菌，瘢痕疙瘩样芽生菌等，同时可接种于沙氏琼脂。
9．尿液：
采集早晨第1次清洁尿液、耻骨上联合穿刺尿液或导管尿液10~50 ml。不能采用24 h尿液。2 h内常温送检，若不能及时送检，则4 ℃保存，但不能超过72 h。尿液真菌培养不推荐定量检测菌落计数，因其与疾病的严重程度相关性存在争议。
10．生殖道标本：
男性患者可用无菌特制的尿道拭子伸入尿道口内2 cm，用足够压力旋转5~10 s；女性患者采集阴道、宫颈分泌物，在阴道扩张器帮助下用无菌拭子插入宫颈口1.5 cm处采集，拭子取出时不要碰到阴道壁，放入无菌管中立即送检。标本量一般较少，要防止干燥，影响致病菌的存活率。取阴道分泌物前避免性生活及阴道冲洗与用药。
11．粪便：
置无菌容器内立即送检。挑取含脓血、黏液部分的标本，如遇液状宜取絮状物。应在2 h内送检，标本置放时间过久可因粪便中细菌繁殖抑制了致病真菌的生长。一般不推荐粪便作真菌检查，因考虑肠道内可以有念珠菌正常菌群，除非标本镜检发现大量的菌丝及菌落生长。
12．皮屑、甲屑及毛发标本：
不能置冰箱保存，因皮肤癣菌对低温敏感。
皮屑：用经消毒的刮刀刮取皮损活动边缘皮屑及深层趾（指）间皮屑，水疱取疱壁，取材前用75%酒精消毒，作KOH或荧光染色涂片，同时种于含氯霉素的沙氏琼脂斜面，置25~28 ℃培养2周。怀疑马拉色菌的标本接种于含橄榄油或其他脂质的培养基，置35~37 ℃培养2周[16]。
甲屑：用刮刀、细挫采集病甲甲下碎屑，标本用75%酒精浸泡待干燥后分别种于含氯霉素及含放线菌酮的沙氏琼脂斜面，置25~28 ℃培养3~4周，并同时作KOH或荧光染色涂片。甲板内真菌活力较弱，培养阳性率不高，增加标本接种量及平皿多点接种可以提高培养的阳性率。放线菌酮可抑制污染真菌生长。
毛发：取病发（变色、无光泽、弯曲、脆易折断、松动易拔除）10~12根经75%酒精消毒自然干燥，3~5根作直接镜检，5~7根种于含氯霉素的沙氏琼脂斜面。头癣的病发镜检可见发内菌丝、发内孢子、或发外孢子[3]。
13．免疫学试验标本：
包括真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测（G试验）、隐球菌荚膜多糖抗原检测和曲霉半乳甘露聚糖检测（galactomannan，GM）。
G试验：使用专用的无热原真空采血管，空腹采血，分离血清。黄疸、溶血、脂血标本会影响实验结果，不推荐检测。若不能及时检测，分离血清置于2~8 ℃下保存24 h；或在无热原专用离心管内－20 ℃下可保存1周[12]。
隐球菌荚膜多糖抗原检测：采集血清及脑脊液。胶体金免疫层析法还可采用血浆。
GM：血清及支气管肺泡灌洗液。黄疸、溶血、脂血等标本会影响实验结果。如标本不能及时检测，可置2~8 ℃，48 h内检测。如48 h内不能检测，需－20 ℃以下保存。支气管肺泡灌洗液需离心取上清液检测[12]。
（二）标本形态学检查
标本的形态学检测能客观评估标本质量，修正培养结果；对于合格标本应根据标本特点选择高特异度和高敏感度的方法以覆盖几乎所有真菌，包括部分尚无法人工培养或培养生长非常缓慢的真菌。标本的形态学检查应作为真菌性疾病诊断强烈推荐的检测项目。
1．真菌免疫荧光法：
建议临床标本直接用钙荧光白（calcofluor white，CFW）或博兰卡风（Blankophor）荧光染色检测。该方法几乎可以检测所有真菌，并且具有高度敏感度和特异度。但荧光染色除了真菌外，动脉壁、肺泡和细支气管上的弹性纤维、外源性的植物纤维、脂肪滴、寄生虫也可以发出亮蓝色的荧光，但结合形态容易区分。造成假阴性的因素有未使用适合波长段的滤光片、标本涂片太厚、染液量过少、染色时间过短、荧光淬灭物质存在等。直接免疫荧光法可以用于检测耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jeroveci），但部分荧光商品试剂无法使肺孢子菌着色应引起注意。暗色真菌新鲜培养物的菌丝和孢子可以呈现强烈荧光，陈旧培养物的菌丝和孢子荧光不着色或荧光信号很弱，易漏检[18,19,20]。
2．10%KOH法：
KOH常用于处理感染的皮肤、指（趾）甲、毛发和组织标本，其能使角质层细胞溶解但不会破坏真菌孢子和菌丝而易于观察。对于角质层较厚的皮屑、甲屑和组织块，可以将KOH浓度适当提高（20%），酒精灯上微加热以加快角质层溶解。KOH处理后的真菌菌丝有明显折光性，其立体感强、粗细均匀、形态一致、弯曲自然，而上皮细胞边缘、纤维等异物无此特点。对于组织标本，KOH配合荧光染色能明显提高真菌检测的敏感性[21]。
3．革兰染色：
酵母菌革兰染色呈现蓝黑色圆形孢子，毛霉目、曲霉属、镰刀菌属等丝状真菌多呈革兰阴性菌丝，易漏检，对于高度怀疑真菌感染标本，应使用更特异的真菌染色方法进一步明确。
4．特殊真菌检查：
怀疑隐球菌感染可以使用墨汁、黏蛋白卡红染色法；怀疑肺孢子菌感染使用六胺银、甲苯胺蓝、吉姆萨染色法；怀疑马尔尼菲篮状菌、组织胞浆菌感染使用瑞氏、吉姆萨、荧光染色法；常规HE染色的怀疑真菌感染的组织，进一步使用荧光、六胺银、PAS等特异的真菌检测方法。真菌的不同染色涂片镜检方法见图1。
注：A图示毛霉（脓液，六胺银染色×400），B图示耶氏肺孢子菌（支气管肺泡灌洗液，六胺银染色×1 000），C图示曲霉（痰，钙荧光白染色，×1 000），D图示曲霉（支气管肺泡灌洗液，10%KOH×400）
图1 真菌的不同染色涂片镜检方法
（三）真菌培养
1．适用条件：
确定临床标本中病原真菌的种类，提高对病原体检出的阳性率，保存菌种，确定病原真菌的药物敏感性、筛选耐药菌株。感染部位合格标本中培养出明确的致病菌时可确立诊断。
2．所用培养基的种类和意义[22]：
包括基础分离培养基和特殊培养基。
基础分离培养基：只提供病原性真菌生长所需要的最基本成分。
沙氏培养基（Sabaurauds agar，SDA）：大多数真菌生长尚可，加入放线菌酮和氯霉素以抑制腐生型真菌（多数可能为条件致病菌）和大多数细菌（并非所有细菌）。放线菌酮也抑制新生隐球菌、一些念珠菌、烟曲霉等，应该引起注意。含4%糖、低pH的SDA用于皮肤癣菌的形态学研究。
脑心浸膏琼脂：用于双相真菌皮炎芽生菌等从菌丝相向酵母相转变时，其中也可以加入抗生素和血液制品。
抑制性霉菌琼脂：氯霉素可抑制细菌的生长而不抑制真菌的生长，用于临床标本最初的增菌培养，常用于筛选防线菌酮敏感的真菌，如隐球菌、组织胞浆菌和接合菌。
特殊培养基：包括咖啡酸琼脂（caffeic acid agar，CAA）、鸟食琼脂、KT培养基和CHROMagar念珠菌显色培养基。CAA：新生隐球菌在CAA培养基中菌落呈黑色；此培养基有助于混合培养物中选择性地培养新型隐球菌。鸟食琼脂：分离痰等污染严重的标本中新型隐球菌。KT培养基：用于皮炎芽生菌转相（为酵母相）培养时使用。CHROMagar念珠菌显色培养基：根据不同颜色鉴定菌种[17]。
3．培养温度：
初代培养建议使用（28±1）℃培养。高温辅助培养有助于部分真菌的鉴定，如烟曲霉在45 ℃培养时可用来区别其他曲霉。双相真菌在37 ℃或组织中可以以酵母或小球体形式生长，常用于区别其他真菌。
4．培养时间：
生殖道或黏膜的念珠菌培养7 d即可。深部标本的真菌培养建议4周。怀疑罕见真菌或慢生长真菌（如荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌等）感染时，建议培养6~8周[23]。
（四）真菌鉴定
1．酵母菌的鉴定：
怀疑酵母菌时首先做湿片镜检，对于黏液型菌落、镜下呈圆形或略椭圆形、无假菌丝的出芽酵母菌应立即判断是否为新型隐球菌/格特隐球菌，可进一步用墨汁染色检测是否存在荚膜，但荚膜的大小受培养时间、培养基成分影响，红酵母菌和少见的念珠菌也会产生荚膜样结构。依据是否形成假菌丝、真菌丝、有/无顶生厚膜孢子及芽生孢子的形状和排列方式，并结合其他形态和生化试验，可将酵母菌鉴定至属或种的水平。临床常见酵母菌鉴定流程见图2。
图2 临床常见酵母菌鉴定流程
芽管形成试验：芽管试验是快速推测性鉴定白念珠菌最为简单有效的方法，但不是所有的白念珠菌都是阳性。热带念珠菌也可能出现芽管试验假阳性，但其孢子与假菌丝连接处有明显的缢痕。
显色培养基：培养基放置35~37 ℃、空气中培养36~48 h，平板尽量在暗处储存和孵育。显色培养基只能提供推断性鉴定，2%~10%白念珠菌在显色培养基上形成白色菌落。
糖同化试验：是酵母菌鉴定至种水平的主要方法，但不能区分复合群。
酚氧化酶试验：临床分离的酵母菌中只有新型隐球菌和格特隐球菌可产生酚氧化酶，能使咖啡酸分解为黑色素，表现为深棕色至黑色。
脲酶：用于协助鉴定脲酶阳性的担子菌酵母（隐球菌、马拉色菌、红酵母属、毛孢子菌属）和脲酶阴性的子囊菌类酵母（念珠菌属、酵母菌属、地丝菌属、芽生裂殖菌属）。
分子生物学技术：DNA直接测序和MALDI-TOF质谱技术对酵母样真菌鉴定准确率高，对生化表型不能区分的复合群或菌种能准确鉴定。
2．丝状真菌的鉴定：
丝状真菌主要通过菌落形态以及显微镜下真菌孢子、菌丝、产孢等特征性结构进行初步判断种属，菌落主要观察其生长速度、质地、高度、边缘形态、正反面颜色等，菌丝应注意是否分隔、颜色、形态（球拍、关节等）、附着结构（假根、附着孢等），产孢结构包括孢子的形态、大小、颜色、聚集模式、产孢方式、厚壁孢子等。显微镜检查最好使用透明胶带法或小培养法。准确的菌种鉴定常需要分子生物学技术。MALDI-TOF MS技术鉴定准确性取决于其数据库及培养和蛋白提取方法等因素。临床常见丝状真菌鉴定流程见图3。
图3 临床常见丝状真菌的鉴定流程
（五）真菌药敏试验
实验室应根据标本和菌株的临床意义决定是否进行真菌药敏试验，并选择正确的药敏试验方法。对于酵母菌，建议仅对分离自组织、血液、无菌体液等标本的菌株或分离自同一患者多个部位的同一菌种（即多部位感染）进行药敏试验，对于分离自呼吸道标本的酵母菌不推荐常规进行药敏试验。对于丝状真菌，应结合患者的临床表现、影像学及其他感染相关检查结果进行分析，仅对具有临床意义的菌株进行药敏试验，如不能除外环境污染的可能，应建议临床多次留样复检并完善其他相关检查。需要注意的是，真菌体外药敏试验结果不一定与体内治疗效果完全一致，低的MIC值不一定预示临床治疗成功，高的MIC值也不一定临床治疗失败。目前的临床药敏折点有一定的局限性，如棘白菌素和伏立康唑对于念珠菌的临床折点主要基于非粒细胞缺乏患者的念珠菌血症感染模型，对于其他感染类型的数据则是有限的，其他药物也存在类似问题[23]。
1．药敏试验方法：
真菌药敏试验的参考方法是微量肉汤稀释法，美国CLSI与欧洲药物敏感性试验委员会（European Committee onAntimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）均有相应的检测方法及判读标准。但由于其操作的复杂性，临床常规检测更适合选择操作简便的商品化试剂，包括改良微量肉汤稀释法、色原底物法、琼脂梯度扩散法和纸片扩散法等，不同方法所适用的菌种范围不同。对于双相真菌，除CLSI指出微量肉汤稀释法可用于申克孢子丝菌菌丝相药敏检测外，目前尚未建立适用于马尔尼菲篮状菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等双相真菌的参考药敏试验方法，可参考相关抗真菌治疗指南选择药物。
2．药敏结果判读：
实验室应严格按照所选择的方法学，进行药敏试验操作和判读，不同药敏试验方法对不同真菌种属所要求的接种物浓度、培养基种类、培养温度、培养时间和判读标准均不同。在真菌药敏结果判读终点上，两性霉素B在不同药敏方法中均以100%抑制菌株生长的最低药物浓度为MIC，其他药物则多以与生长对照相比部分抑制菌株生长的最低浓度为MIC，且不同药敏方法对不同药物MIC读取时的生长抑制程度要求各不相同。曲霉菌对棘白菌素类应报告其最低有效浓度（minimaleffective concentration，MEC）。
3．药敏解释标准：
真菌药敏结果的解释，应选择与所使用检测方法学相对应的体系标准。对于尚未建立临床折点的药物，部分真菌可提供其流行病学界值（epidemiological cutoff values，ECVs/ECOFFs）或药代动力学/药效学（pharmacokinetic/pharmacodynamic，PK/PD）折点供临床参考。对于酵母菌，CLSI与EUCAST均提供了念珠菌属临床常见菌种的临床折点，CLSI还提供了新型隐球菌和格特隐球菌的流行病学界值。对于丝状真菌，CLSI未建立临床折点，但提供了曲霉属部分常见菌种ECVs，EUCAST对曲霉属部分菌种提供了临床折点。棘白菌素类药物中卡泊芬净药敏试验结果在不同实验室间差异较大，EUCAST未给出折点，建议参考米卡芬净和阿尼芬净结果对其进行评价；CLSI虽提供了折点但仍指出，当出现卡泊芬净中介或耐药时应进行确认，当米卡芬净或阿尼芬净耐药或菌株存在FKS基因热点区突变时，可报告耐药。药敏结果报告中应注意所使用判读标准适用的感染或标本类型。此外，建议在报告中进行说明天然耐药的情况。另外在特定感染部位浓度过低、不适用于此类感染治疗的药物不建议报告其药敏结果，可以在药敏报告中进行说明，如对于尿标本分离株不建议报告棘白菌素类、伏立康唑、泊沙康唑和两性霉素B，对于中枢神经系统感染分离株不建议报告棘白菌素类的药物敏感性等[24,25,26,27,28,29,30,31,32,33]。
（六）侵袭性真菌病的免疫学诊断
免疫学诊断是指应用免疫方法检测血清或其他体液中的真菌抗原、抗体和代谢产物进行侵袭性真菌感染的实验室诊断。
1．抗原检测：
包括1，3-β-D葡聚糖检测、半乳甘露聚糖检测和隐球菌荚膜多糖抗原检测等。
1，3-β-D葡聚糖检测：1，3-β-D葡聚糖（1，3-beta-D-glucan）是酵母菌和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分。除血清外，还可采集肺泡灌洗液等标本送检。用于侵袭性真菌（隐球菌、接合菌、皮炎芽生菌酵母相除外）感染的辅助诊断。阳性结果提示真菌感染，但不能作为确诊指标。导致假阳性结果的因素有：使用以真菌为原料的抗生素；放化疗引起黏膜炎症；静脉输注血液制品（白蛋白、球蛋白、凝血因子等）；血液透析用纤维素膜；使用纤维棉纱等含葡聚糖的材料；某些多糖类抗肿瘤药物（如香菇多糖）等。
半乳甘露聚糖检测：半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）是曲霉菌细胞壁的一种多聚糖，检测血清、支气管肺泡灌洗液GM含量有助于诊断侵袭性曲霉菌病（invasive aspergillosis，IA）和评估治疗效果。阳性结果提示真菌感染，但不能作为确诊指标。阴性结果不能排除IA，若临床怀疑IA建议重复送检。IA高危患者应建立血清GM基线水平并每周送检两次，以便在危及生命的感染发生之前抢先抗真菌治疗。GM水平还有助于评估治疗效果。该试验假阳性率8%~14%，至少连续两次送检标本为阳性，才可考虑患者GM试验为阳性。使用阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦亦出现假阳性。交叉反应见于青霉菌、皮炎芽生菌、链格孢、隐球菌等。在非中性粒细胞减少症和实体器官移植患者中GM试验敏感性较低，不推荐监测血清GM。
隐球菌荚膜多糖抗原检测：隐球菌的荚膜多糖抗原常用检测方法有酶联免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）、乳胶凝集实验（latex agglutination test，LA）和侧向层析实验（lateral flow test，LFD）。隐球菌抗原检测是肺隐球菌病和隐球菌性脑膜炎等隐球菌感染的临床快速诊断方法。常用标本为血清和脑脊液，亦可使用支气管肺泡灌洗液。EIA的敏感度和特异度与LA相当，但类风湿因子（rheumatoid factor，RF）可引起LA假阳性，而EIA不受影响。LFD方法简便，血清检测敏感性和特异性高于EIA和LA。感染毛孢子菌、噬二氧化碳细胞菌属，口腔球菌属、白吉利地霉等可能出现假阳性。常见假阴性原因为抗原浓度过低或过高引起带效应。
2．抗体检测：
检测抗曲霉菌IgG和IgE抗体有助于诊断过敏性支气管-肺曲霉菌病（allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）和慢性空洞性曲霉菌病。单独用抗体进行念珠菌属诊断的敏感度和特异度均较低，建议念珠菌甘露聚糖抗原及其对应抗体联合检测。其他可检测球孢子菌抗体、组织胞浆菌抗体等有助于疾病诊断或可用于判断预后。常见侵袭性真菌感染的免疫学检测技术评价见表3。
表3 常见侵袭性真菌感染的免疫学检测技术评价
（七）侵袭性真菌病的分子诊断
分子诊断方法大多在培养的基础上进行病原真菌分子鉴定，也有报道实时PCR技术、液相芯片、焦磷酸测序、质谱、宏基因组测序等分子技术可直接从液体培养瓶甚至临床标本中进行病原检测[40]。目前由于体液中真菌载量低、DNA抽提困难、易污染、无临床判定标准等问题，分子诊断尚未写入侵袭性真菌病的诊断标准中。
1．PCR技术：
PCR方法是目前分子诊断中最为常用的方法[41]，针对真菌靶基因设计特异性引物，提取标本的DNA，经过PCR检测真菌相关基因。真菌靶基因选择主要为核糖体RNA基因，包括：18S、ITS1，5.8S、ITS2、28S区域等，已应用于直接从临床标本中检测、鉴定真菌。使用PCR技术对侵袭性真菌病进行分子诊断的研究主要集中于曲霉菌和念珠菌感染，也见于一些少见真菌如接合菌感染中。在确诊或疑似侵袭性念珠菌病患者中，PCR方法的阳性率为85%（78%~91%），而血培养的阳性率为38%（29%~46%）[42]。
2．质谱检测技术：
MALDI-TOF MS在侵袭性真菌感染分子诊断方面的应用研究多见于对固体培养基上分离得到的临床菌株进行鉴定，对酵母菌的鉴定准确率在84%~99%之间不等[43]，且与判定值的设置有关。MALDI-TOF MS鉴定方法目前仍以固体/液体培养形成一定数量的真菌菌落为前提，尚无直接从临床标本中直接检测真菌的报道，且对复合感染中同时存在的多种病原体无法鉴定。
3．其他分子诊断技术：
PCR-电喷射电离质谱技术是将广谱PCR与电喷射电离质谱技术整合于一个系统。
焦磷酸测序在侵袭性真菌病分子诊断中的应用多见于对酵母菌，尤其是念珠菌的分离菌株进行鉴定。
另外，核酸杂交、液相芯片、DNA微点阵基因芯片、宏基因组[44]等技术在侵袭性真菌病的分子诊断方面的应用也逐渐增多，均可检测多种病原体，对真菌感染的分子诊断有重要意义。
六、对于真菌检测质量保证的要求
（一）方法学性能验证
任何新的真菌检测技术临床使用前，应查阅已发表的完整、科学的系统评估文献或厂家说明书，确定检验程序的性能特征。然后实验室进行独立的性能验证，通过获取客观证据（以性能特征形式）证实检验程序的性能与其声明相符并与预期用途相关。
应按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其他已知菌株对商业鉴定系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的直接镜检、鉴定/药敏结果符合性进行验证。应根据分析类型和用途进行验证程序的设计、验证结果的统计学分析、建立新检验程序的可接受性能标准。验证结果应证明该检验程序可用于检测或准确分析待测物。若不符合需重复验证，再次验证仍不能通过时应对检测系统进行修正。
（二）室内质控
应贮存与诊断相配套的质控物，以便在染色、试剂、试验、鉴定系统和抗菌药物敏感性试验中使用。药敏用标准菌株种类和数量应满足工作要求，保存其来源、传代等记录，并有证据表明标准菌株性能满足要求。
1．涂片：
直接染色（如墨汁染色）检查患者样品时，应在实验当日做阴性和阳性质控（某些染色如KOH染色，玻片本身作为阴性质控）。荧光染色应每次实验以阴性和阳性质控验证。标本直接镜检真菌染色基本质控要求见表4。
表4 标本直接镜检真菌染色基本质控要求
2．培养：
真菌培养使用的所有培养基、试剂和耗材均需有质量合格证。每批次、货次的培养基、试剂都需验收其性能。通常使用质控菌株的生长、抑制试验，按照常规操作程序孵育后观察足够生长、典型形态，对于选择性培养基则观察是否抑制目标菌生长。
3．药敏试验：
质控菌株重悬在含50%甘油肉汤中冻存于－70 ℃。使用时，质控菌株接种于沙保弱平板上，存放于2~8 ℃，每周传代，连续传代不超过3次。至少每月将冻存的质控菌株复苏1次备用。药敏试验前冻存的质控菌株应传代至少两次。质控频率：连续30 d检测所有质控菌株药敏并记录结果，当每种药物对每个菌株的药敏结果不超过3次失控时，可以由日质控转为周质控。周质控时当单个MIC失控时，要重新进行日质控并解决失控的问题，确保所有的MIC值均在控。在重新周质控之前，需要连续进行30 d日质控。质控菌株检测结果应符合CLSI M60、M61文件要求。
4．免疫学试验：
商品化检测系统应严格使用配套试剂和适用的质控物，检测结果应符合厂家性能特征要求。
5．分子生物学检测：
真菌分子生物学检测过程中所使用的所有试剂、耗材均需有质量合格证。每批次、货次的试剂、耗材都需验收其性能，并做记录。质量控制程序中应有针对核酸检测防污染的具体措施。每次实验应设置阴性、弱阳性和/或阳性质控物，检测结果阴阳性符合预期。每次检测应覆盖核酸提取、扩增和结果判读全过程的质量控制。
（三）实验室比对
1．室间比对：
按要求参加相应的能力验证/室间质评。应对'不满意'和'不合格'的能力验证/室间质评结果进行分析并采取纠正和预防措施。对没有开展能力验证/室间质评的项目，应至少每6个月与其他实验室（或其他试验方法）进行1次性能比对评估试验。
2．室内比对：
包括人员比对和设备或方法比对。
人员比对：应制定人员比对的程序，规定由多个人员进行的手工检验项目比对的方法和判断标准，至少包括显微镜检查、培养结果判读、抑菌圈测量、结果报告，定期（至少每6个月1次，每次至少5份临床样品）进行检验人员的结果比对、考核并记录。
设备或方法比对：实验室在开展多种染色方法（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）时，或同时开展手工染片法和自动化染片法时，应进行不同方法/设备的实验室内部比对。至少每6个月1次，每次至少5份临床样品，并包含阳性、阴性结果。
七、真菌实验室检测报告要求
（一）报告内容
1．基本信息：
患者信息、标本信息、临床信息。
2．检测信息：
标本唯一编号、接收时间、审核时间、检测者签字、审核者签字或者诊断者签字、实验室名称、地址、联系电话。
3．检测报告：
标本质量描述、检测项目、检测方法、检测结果、参考区间、结果解释、备注。
（二）报告格式
1．镜下形态学检查[45]：
（1）标本质量描述、检测项目、染色方法、检测结果、结果解释。（2）观察孢子和菌丝的形态、位置、大小和排列、产孢结构等特征，以提示真菌种属，菌丝要区别真假菌丝及相应的形态描述。（3）无菌部位标本涂片检查，报告查见（未查见）真菌孢子及菌丝。（4）非无菌部位标本涂片检查，报告时对真菌孢子数量描述可参考细菌的报告模式。（5）酵母样孢子：建议报告'查见真菌孢子，疑似酵母菌'。（6）酵母样孢子和假菌丝：建议报告'查见酵母样真菌孢子及假菌丝'。（7）墨汁染色见有宽厚荚膜的酵母样孢子：建议报告'查见真菌孢子，有宽厚荚膜，疑似隐球菌'。（8）透明、有隔菌丝，约45°角分枝，鹿角样：建议报告'查见真菌菌丝，有隔、45°角分枝，鹿角样，疑似曲霉菌'。（9）透明、无隔或者少隔菌丝，菌丝宽大，约90°分枝：建议报告'查见真菌菌丝，宽大无隔、90°角分枝，疑似毛霉或虫霉'。（10）棕色或黑色菌丝或孢子：建议报告'查见真菌孢子或菌丝，棕色多形性，疑似暗色真菌'。（11）结果解释：无菌部位取材标本涂片阳性提示真菌感染可能。非无菌部位取材涂片阳性时应结合临床其他检查，若标本不合格，备注：标本取材不合格，建议复查。（12）如果在报告单插入图片，注意图片的选择和质量。选取的单图或组图，一般包括图题、图注等信息准确完整，包括染色方法、真菌描述、放大倍数和其他有必要添加的简单说明等。图片应清晰、线条清楚，分辨率高，图片宽度适宜。组图按先后顺序命名，插入按预定顺序展示。
2．培养鉴定药敏结果：
包括培养阳性报告、培养阴性报告和药敏报告。
培养阳性报告：（1）无菌部位标本：结合标本质量和临床信息报告实际培养结果。（2）非无菌部位培养阳性：酵母菌的量值报告方式可参考细菌报告方式。丝状真菌的量值报告方式目前尚存争议，其临床意义判断需结合其他临床证据，如组织病理结果等。（3）结果解释：非无菌标本，视情况而定，两个试管/平板有同一形态真菌生长或真菌镜检同时阳性者提示可能有临床意义；仅一管生长，生长部位非接种部位，菌落为霉菌样则可能是污染，备注：可疑污染，建议复查[46]。菌株是否为致病菌需结合标本质量、直接镜检结果和患者临床症状体征、影像学及其他检查结果，与临床充分沟通后综合分析判断是否需要对菌株进行药敏实验。
培养阴性报告：初步报告：培养7 d无真菌生长，建议发初步阴性报告'培养7 d无真菌生长'。根据标本类型和怀疑病原菌的不同，培养时间可相应延长。终报告：延长培养时间并在初步报告中注明，第2周开始每周观察，无真菌生长后可根据最终培养时间发出终报告'培养XX周无真菌生长'[30]。
药敏报告：酵母菌结果判读：按照CLSI或EUCAST规定的药敏试验判定折点进行判读，报告具体药敏检测值及药敏判定结果，如S=敏感，I=中介，R=耐药，SDD=剂量依赖敏感。丝状真菌药敏试验临床折点CLSI尚未确定[24]。当抗真菌药物尚无临床折点时，可根据CLSI或EUCAST已公布的ECV/ECOFF报告菌株为野生型（wild type，WT）或非野生型（non-wildtype，NWT）。需要明确的是，WT或NWT仅提示菌株有无携带获得性耐药机制或突变型耐药机制，不指示临床预后。
3．非培养方法：
包括G、GM、隐球菌抗原检测等。报告内容包括标本质量描述（支气管肺泡灌洗液的质量、血液标本溶血、黄疸、乳糜血等）、检测项目、检测结果、参考区间、结果解释。
（三）危急值报告
血液、脑脊液等无菌体液标本显微镜检查及培养阳性结果建议立即报告临床[30]。
八、菌株保留的要求
（一）短期保存方法
包括直接传代法、矿物油法和蒸馏水法等，保存过程中需注意防止污染[17,22]。
（二）长期保存方法
包括超低温冷冻和冻干法。超低温冷冻法优点为省力省空间，存活率高，突变率低，但培养物运输较困难，需要低温冰箱或液氮罐等设备[47,48]。冻干后便于运输，但操作过程复杂，需要冻干机等设备[49]。
真菌菌种保存方法适用范围见表5。
表5 真菌菌种保存方法适用范围[47,50]
九、信息化系统的要求
信息全流程应包括医嘱开单、标本采集、标本送检接收、标本检测、报告审核、报告展示、菌种保存等，流程中涉及的参与人和时间点需要全程记录，信息可追溯。医院信息系统（hospital information system，HIS）和实验室信息系统（laboratory information system，LIS）同时支持多种报告模板的生成和展示，例如形态图文报告、鉴定培养药敏报告、非培养方法报告等，报告内容和报告格式参照上文相关要求。LIS支持不合格标本和危急值报告的处置。LIS支持与检测设备的信息通讯，单向传输或双向传输。
编审专家
编审专家（排名不分先后）：刘正印、马小军、刘晓清（中国医学科学院北京协和医院感染内科）、吴洁（中国医学科学院北京协和医院检验科）、杜斌（中国医学科学院北京协和医院内科ICU）、廖泉（中国医学科学院北京协和医院外科）、朱兰（中国医学科学院北京协和医院妇产科）、梅丹（中国医学科学院北京协和医院药剂科）、李若瑜（北京大学第一医院皮肤性病科）、郑波（北京大学第一医院感染科）、王明贵、胡付品（复旦大学附属华山医院抗生素研究所）、俞云松（浙江大学医学院附属邵逸夫医院感染科）、卓超（广州呼吸疾病研究所）、吕晓菊（四川大学华西医院感染科）、刘又宁（解放军总医院第一医学中心呼吸科）、王睿（解放军总医院第一医学中心临床药理研究室）、马军（哈尔滨市第一医院血液肿瘤研究所）、吴德沛（苏州大学附属第一医院血液内科）、邱海波（东南大学附属中大医院重症医学科）、黎毅敏（广州医科大学附属第一医院重症医学科）、石远凯（中国医学科学院肿瘤医院肿瘤内科）、顾晋（北京大学首钢医院）、王行环（武汉大学中南医院泌尿外科）、张力伟（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科）、申昆玲、杨永弘（首都医科大学附属北京儿童医院）、张曼（首都医科大学附属北京世纪坛医院检验科）、史录文（北京大学医学部）、曾宪涛（武汉大学中南医院循证与转化医学中心）、马筱玲（中国科技大学附属第一医院检验科）、刘晓琳（中国药师协会、国家卫生计生委合理用药专家委员会）、胡继红（北）、王辉（北京大学人民医院检验科）、吕媛（北京大学第一医院临床药理研究所）、杨滨（福建医科大学附属第一医院检验科）、魏莲花（甘肃省人民医院检验科）、林勇平（广州医科大学附属第一医院检验科）、王忠芳（广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室）、姜晓峰（哈尔滨医科大学附属第四医院检验科）、韩崇旭（江苏省苏北人民医院检验科）、林宁（南京医科大学附属淮安一院检验科）、李俊明（南昌大学第一附属医院检验科）、刘勇（中国医科大学附属盛检验科）、贾伟（宁夏医科大学总医院检验科）、卢志明（山东省立医院检验科）、朱镭（山西省儿童医院检验科）、侯锐钢（山西医科大学第二医院药学部）、刘小平（北京大学深圳医院检验科）、刘文恩（中南大学湘雅医院检验科）、赵明（国家食品药品监督管理总局药品评价中心）、凌健华（香港威尔斯亲王医院检验科）、刘玉庆（山东省农业科学院畜牧兽医研究所）、鲁辛辛（北京同仁医院检验科）、苏建荣（首都医科大学附属北京友谊医院检验科）、汤一苇（美国纽约斯隆-凯特琳肿瘤纪念医院临床微生物科）、肖永红（浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室）、薛博仁（台湾大学医学院附属医院感染科）、尹红（瑞典法路医院临床微生物科）、游雪甫（中国医学科学院医药生物技术研究所）、张建中（中国疾病预防控制中心传染病预防控制所）
志 谢
谢 感谢中国医院协会临床微生物实验室管理专业委员会和欧洲临床微生物和感染病学会药敏委员会华人抗菌药物敏感性试验委员会的编审专家为本共识提供撰写过程中的学术支持。感谢中国初级卫生保健基金会提供专家联络服务
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