京港感染论坛
早诊快诊，助力精准防治
论文摘要
传染病是对人类健康最大的威胁之一，造成巨大的伤残和死亡负担。对传染病快速诊断和治疗可以更好地理解其致病机制。世界卫生组织(WHO)认为理想的检测外来病原体方法应是快速、特异、灵敏、无需复杂仪器、且具有成本效益。目前的病原体核酸检测方法(典型的是PCR方法)具有许多局限性，例如需要复杂的仪器和试剂、专门的PCR实验室、经过训练的技术人员，而且检测耗时长。因此迫切需要研发快速、灵敏、特异、成本低的新型核酸检测方法，尤其是可用于不同场景的床旁诊断装置。SHERLOCK和DETECTR两种新方法基于CRISPR-Cas效应分子的体外特性，将活化的核酸酶与特异性核酸结合，然后这些效应分子与各种报告基团结合，并同时联合等温扩增方法，建立了在多种模式下的高灵敏度检测方法。尽管仍处于起始阶段，SHERLOCK和DETECTR有望快速检测病原体，具有超高灵敏度，且不需要复杂的检测过程。本综述介绍了SHERLOCK和DETECTR技术，并评估了它们的性能、功能、以及作为诊断传染病和遏制疾病暴发最佳诊断工具的前景。
一、通过CRISPR-Cas系统检测核酸
CRISPR-Cas系统在2016年第一次应用于分子诊断，它的特征和应用见表1。Kellner团队研发的基于CRISPR诊断技术结合了核酸预扩增和CRISPR-Cas酶学特点，来特异性识别靶DNA或RNA，称为“Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking”，即SHERLOCK技术。它可以多重靶标、便携、高灵敏地检测临床样本中DNA和RNA序列。2018年张峰团队建立了基于VI型CRISPR-Cas系统的SHERLOCK，它依赖于Cas13核酸酶，特异性识别和切割RNA。如果样本中有靶核酸片段，Cas13能通过CRISPR相关RNA(crRNA)识别它们并切开荧光探针的序列，使荧光基团与淬灭基团失去相互作用，释放出可检测的荧光信号，但它只能定性而不能定量检测。
第二代SHERLOCKv2通过加入Cas13a和Csm6可以提高信号强度，从而使灵敏度增加3.5倍。此外第二代SHERLOCKv2可检测多重靶标，每种报告探针设计为独特的序列并标记不同荧光素，然后设计对应的向导RNA序列。SHERLOCKv2通过商品化的侧流试条，可肉眼观察颜色变化来判读结果，且不需要特殊仪器。它仅需把样本加入试条一步操作，不需要分离纯化核酸。总之，SHERLOCKv2具有超高的敏感性，可实现多重靶标检测，并通过侧流试条显色来肉眼判读结果。
2017年Jennifer Doudna团队研发的“DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter”，即DETECTR技术。它依赖Cas12a识别靶RNA后活化的Cas12a蛋白活性，可降解附近DNA序列。Cas12a和靶标crRNA与单链DNA报告探针互补结合并加入临床样本中，crRNA识别病原体核酸序列，然后破坏DNA报告探针释放荧光信号。DETECTR起始阶段加入恒温预扩增的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)来富集靶序列，可增加检测灵敏度且不依赖复杂和昂贵的仪器。不同Cas酶(Cas9、Cas12a和Cas13a)的功能和特征见表2。
图1. SHERLOCKv2、SHERLOCK、DETECTR三种检测系统的模式图。无靶核酸时Cas核酸酶为无活性状态。当向导crRNA与相应序列(Cas13a为RNA，Cas12a为ssDNA或dsDNA)结合时，核酸酶被激活可切割相应序列，此时通过一段寡核苷酸(黑色)与淬灭基团连接的荧光报告基团(绿色)可发出不断增强的荧光信号。临床样本在核酸提取后，通过恒温预扩增的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)或逆转录RPA来扩增靶DNA或RNA。RPA产物在含有T7 RNA聚合酶、Cas13、靶标特异性crRNA和RNA荧光报告基团的反应体系中被检测出来。
表1. 基于CRISPR-Cas诊断工具的特征和应用
表2. Cas9、Cas13a、Cas12a酶的功能和结构特征
二、基于CRISPR诊断方法与PCR方法的比较
PCR的优点是病原学分子诊断中最经典和有效的方法，能检测出低至一个拷贝的病原体基因组。局限性是需要复杂的热循环仪器，缺乏标准化的操作流程，需要处理试剂，需要完善的实验室环境和合格检测的人员，耗时长且无法用于大范围人群筛查。
CRISPR的优点是超敏、特异、无需复杂仪器和操作、通过等温扩增和Cas-sg/crRNA复合物对目的序列的特异性识别来提高准确度。局限性为仅能检测已知序列。
建议进行大规模的关于各种基于PCR和基于CRISPR-Cas诊断方法的比较研究。
三、基于CRISPR的诊断系统用于检测新发传染病
在新型冠状病毒检测中，DETECTR检测SARS-CoV-2特异性N基因和E基因，如果两个基因同时阳性则可报阳性结果，并且该方法经过改进可排除其它冠状病毒引起的假阳性结果，且能在1h内出结果。而SHERLOCK主要检测SARS-CoV-2的S基因和Orflab基因。
四、CRISPR诊断技术的潜在应用
DETECTR最显著的特征是它准确性高、耗时非常短(见图2)，它可用于在人乳头瘤病毒(HPV)感染的细胞系或临床样本中检测HPV及分型。SHERLOCK能通过细菌16S rRNA基因V3可变区的RPA通用引物来鉴定细菌，也可用于细菌和病毒的鉴定和分型，以及耐药基因检测。SHERLOCK具有分辨单个碱基突变的能力，所以可用来筛查单核苷酸多态性(SNP)。
图2 DETECTR、SHERLOCK和CDC/WHO推荐方法(PCR法)检测新冠病毒所需时间比较
五、不同CRISPR检测系统的优势和局限性
SHERLOCK具有超高的灵敏度和特异度，能在1μl样本中检测出单分子的DNA或RNA靶标，在按比例增加预扩增体积后，可在更大量的样本(高达540μl)中实现单分子靶标检测。有赖于Cas13和Cas12酶的特异性，SHERLOCK试剂冻干或长期保存而不会影响灵敏度和特异度。SHERLOCK耗时非常短，PRA作为初始反应仅需5-10分钟，然后转移到Cas13检测系统，这步只需5分钟。SHERLOCK的另一个优势是它相比于其它检测系统(例如TaqMan-qPCR)价格非常便宜。
然而SHERLOCK在某些情况下也有局限性，例如它目前有些反应试剂组分的制备在蛋白纯化和RNA生物学方面较为复杂，预先设计的试验包括反应混合物和DNA/RNA多聚核苷酸目前仍没有商品化。因此如果不是对检测速度和便携性有很高要求，例如肿瘤学检测中，现有的检测方法(比如PCR)可能更适用于这些场景。SHERLOCK的另一个潜在局限性是它的多步骤核酸扩增过程，可能影响对靶标的精确定量。尽管可用于定量，但是它不能像微滴式数字PCR那样做到绝对定量。它不能检测出靶标含量的细微差别(<2×变化)。因此SHERLOCK在精确基因表达谱检测中应用较少。
DETECTR最重要的特点是速度快，其它优势包括不需要复杂仪器(便携性)，很少出现假阳性结果。它可在70-300copies/μl范围内实现单分子检测，并可用于区分病毒亚型。
一般来说，CRISPR-Cas方法仅能用于检测已知DNA序列，这在某些情况下应用受到了限制。
六、总结
SHERLOCK和DETECTR开启了分子诊断的新时代。它们具有便携、敏感性高的优势，适用于诊断新发传染病和非传染病，且耗时仅在1小时内。但它也同样面对着一些挑战。
尽管刚刚起步，SHERLOCK和DETECTR有望改变我们对病原体的诊断能力。它具有超高敏感度且不需要复杂操作，因此适用于人群筛查从而可更好地控制传染暴发。因为其成本低，所以适用范围很广，尤其是资源短缺的国家。因此我们相信CRISPR-Cas系统正在引领一场生物技术革命。
参考文献（上下滑动）
Mustafa MI, Makhawi AM. SHERLOCK and DETECTR: CRISPR-Cas Systems as Potential Rapid Diagnostic Tools for Emerging Infectious Diseases. J Clin Microbiol, 2021, 59(3): e00745-20.
END
作者｜魏大力、黄磊 北京大学第一医院检验科
单位｜北京大学第一医院检验科
审校｜马立艳 北京友谊医院检验科
联系客服
