参考教材一：人民卫生出版社 《临床血液学检验（第5版）》
参考教材二：人民卫生出版社 《临床血液学检验技术》
【第一部分】骨髓细胞学检查
骨髓细胞学检查：通过普通显微镜进行骨髓细胞学检查，可以了解骨髓中各种血细胞数量、细胞形态有无异常等，从而诊断、协助诊断疾病，观察疗效及判断预后。
一、骨髓细胞的类型
骨髓中血细胞包括粒细胞系统、红细胞系统、单核细胞系统、淋巴细胞系统、浆细胞系统及巨核细胞系统等。此外，骨髓中还可见组织嗜碱细胞、吞噬细胞、组织细胞、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞等。
骨髓中血细胞根据细胞形态学可辨认的发育阶段分为原始细胞、幼稚细胞及成熟细胞三个阶段。其形态特点见下图：
血细胞发育过程中形态演变规律，见下图：
二、骨髓穿刺的方法
骨髓穿刺部位选择一般要从以下三个方面考虑：
①骨髓腔中红骨髓要丰富；
②穿刺部位应浅表、易定位；
③应避开重要脏器。
1、常用的穿刺部位：
髂骨前、髂骨后上棘，胸骨、胫骨等。抽吸的骨髓量应不超过 0.2ml。
髂骨前、后上棘此部位骨质薄，进针容易，骨髓液丰富，被血液稀释的可能性小，故髂后上棘为临床上最理想穿刺部位。
2、取材情况判断：
(1)取材满意
①抽吸骨髓液时，患者感到有瞬间的酸痛感(有的患者无这种感觉)；
②抽出的骨髓液中有较多的黄色小粒(多为骨髓小粒，有的是脂肪)；
③镜检见骨髓特有细胞：幼稚粒细胞、有核红细胞、巨核细胞、浆细胞、造骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、肥大细胞、组织细胞、吞噬细胞等；
④中性杆状核粒细胞/分叶核粒细胞比值大于外周血中性杆状核粒细胞/分叶核粒细胞比值，有核细胞数大于外周血有核细胞数。
(2)取材失败
①骨髓稀释：
a. 部分稀释：抽吸骨髓液时混进血液。骨髓小粒、油滴少或不见，骨髓特有细胞少，有核细胞少，成熟细胞/幼稚细胞＞3/5。
b. 完全稀释：抽出的骨髓液实际上就是血液，与血涂片的细胞成分完全一样。
②干抽：是指非技术性原因而抽不出骨髓或只抽到少量血液。常见于原发性和继发性骨髓纤维化、骨髓增生极度活跃、骨髓增生减低、肿瘤骨髓侵润等情况。
三、骨髓细胞学检查的步骤和内容
1、低倍镜观察
(1)判断骨髓涂片质量：观察涂片厚薄、骨髓小粒多少、油滴、染色等，并可选择满意的区域用于有核细胞分类、计数。
(2)判断骨髓增生程度：骨髓有核细胞的多少可以反应出骨髓增生程度。
(3)巨核细胞计数并分类：在低倍镜下计数，在油镜下分类
(4)全片观察有无体积较大或成堆分布的异常细胞(尤其要注意观察血膜尾部等边缘部位)，如骨髓转移癌细胞、恶性组织细胞、恶性淋巴瘤细胞、戈谢细胞、尼曼-匹克细胞、海蓝组织细胞等，
下图：骨髓增生程度分级及标准
2、油镜观察：
在有核细胞计数、分类前，应先观察各系增生程度、形态、大致比例等情况，得出初步诊断意见；然后进行细胞分类、计数及形态观察，必要时细胞分类、计数应在细胞化学染色后再进行。细胞分类、计数时应同时注意观察细胞形态。
下图：骨髓有核细胞计数及分类的方法
巨核细胞计数：由于涂片中巨核细胞较少，一般不归入骨髓细胞有核细胞计数范围，而是单独对巨核细胞计数和分类。通常计数全片或1.5cm×3.0cm的血膜上中巨核细胞数并分类一定数量巨核细胞。
观察内容：应观察各系增生程度、各阶段细胞比例及细胞形态。细胞形态的观察应全面，包括细胞胞体(如大小、形态)、胞核(如核形、核位置、染色质、核仁大小、核仁数量等)及胞质(如量、颜色、颗粒、空泡等)的形态特点等，对于有病变的细胞系统观察更应仔细。
3、结果计算
(1)计算各系统细胞总百分比及各阶段细胞百分比：一般情况下，百分比是指有核细胞的百分比(ANC)。在某些白血病中，还要计算出非红系细胞百分比(NEC)，NEC是指去除有核红细胞、淋巴细胞、浆细胞、肥大细胞、巨噬细胞外的有核细胞百分比。
【小编注】
NEC是FAB协作组对AML进行分型时要用的；而在最新的WHO 2016版造血与淋巴组织肿瘤分类中，NEC已经没什么用场了。
(2)计算粒红比值(granulocyte/erythrocyte，G/E)：所谓粒红比值是指各阶段粒细胞(包括中性、嗜酸性、嗜碱粒细胞)百分率总和与各阶段有核红细胞百分率总和之比。
(3)计算各阶段巨核细胞百分比或各阶段巨核细胞的个数。
4、填写骨髓细胞学检查报告单
(1)填写患者姓名、性别、年龄、科室、病区、床号、住院号、上次及本次髓涂片号、骨髓穿刺部位、骨髓穿刺时间、临床诊断等。
(2)填写骨髓涂片取材、制备和染色情况：可采用良好、尚可、欠佳三级评价标准。
(3)填写骨髓报告单中各阶段细胞百分比、骨髓增生程度、粒红比值等。
(4)文字描述：包括骨髓涂片、血涂片及细胞化学染色三个部分组成。要求简单扼要、条理清楚、重点突出。
①骨髓涂片特征：主要包括粒细胞、红细胞、巨核细胞、淋巴细胞、浆细胞、单核细胞系统的增生程度、各阶段细胞比例及细胞形态。
②血涂片特征：有核细胞数量形态如何，红细胞形态如何，血小板数量及形态如何，有无寄生虫及其他异常细胞。
③细胞化学染色特征：逐项对每个细胞化学染色结果进行描述，每项染色结果的报告一般包括阳性率、阳性指数或阳性细胞的分布情况。
(5)填写诊断意见及建议：根据骨髓象、血象、细胞化学染色及其他检验，结合临床资料提出临床诊断意见或供临床参考的意见，必要时提出进一步检查的建议。对于诊断已明确的疾病，要与以前骨髓涂片进行比较，得出疾病完全缓解、部分缓解、改善、退步、复发等意见，见表。
(6)填写报告日期并签名。
5、标本登记及保存
比如，以下是一个骨髓图文报告范例
附：骨髓涂片的文字描述一般包括这几项内容：
①取材、涂片和染色情况；
②有核细胞增生情况、粒红比值为多少；
③粒细胞系统的百分率、各阶段比例与形态描述。
④红细胞系统的的百分率、各阶段比例与形态描述（包括成熟红细胞）；
⑤巨核细胞的数目、各阶段比例与形态描述，血小板的数目、分布情况；
⑥淋巴细胞系统的百分率，以哪一阶段为主，形态描述。
⑦单核细胞系统的百分率，以哪一阶段为主，形态描述。
⑧有无特殊特殊细胞、结构，有无寄生虫或微生物。
下图：骨髓检查诊断意见种类及特点
6、血涂片检查的重要性
不同疾病其血象或骨髓象存在着不同或相同之处。因此，观察血涂片对疾病诊断和鉴别诊断具有非常重要意义。两者关系主要有以下五种情况：
（1）骨髓象相似而血象有区别：如溶血性贫血、缺铁性贫血和急性失血的骨髓象相似，但血象有区别；神经母细胞瘤骨髓转移时，骨髓中神经母细胞呈弥散性增多，与急性粒细胞白血病相似，但前者血象中中性粒细胞增多伴左移，后者白细胞增多伴原始粒细胞及早幼粒细胞增多。
（2）骨髓象有区别而血象相似：如传染性淋巴细胞增多症和慢性淋巴细胞白血病(简称慢淋)的血象中皆有小淋巴细胞增多，但前者骨髓象中淋巴细胞稍增多，而慢淋骨髓中淋巴细胞却明显增多。
（3）骨髓象变化不显著而血象有显著异常 如传染性单核细胞增多症，其骨髓中的异型淋巴细胞少见，而血象中异型淋巴细胞常大于20％。
（4）骨髓象有显著异常而血象变化不显著 如多发性骨髓瘤、戈谢病、尼曼-匹克病，其骨髓中分别可见到特异性的骨髓瘤细胞、戈谢细胞、尼曼-匹克细胞，但血象中甚少见到。
（5）血象中细胞较骨髓中细胞成熟：血象中血细胞来源于骨髓，因此白血病时血象中的白血病细胞较骨髓中成熟、较易辨认，故结合血象可辅助白血病细胞类型的判断。
四、健康成人的正常骨髓象
五、骨髓象检查的注意事项
不能抓住某一、二个特点就轻易地做出肯定或否定的判断。应全面观察。
涂片制备、染色、观察部位等不同，其显微镜下的细胞形态相差较大。
介于上、下两个阶段间，归入下一阶段。
两个系统之间的细胞，如难以判断，可采用大数归类法（即归入数量较多的系统）。
急性白血病 ，要结合细胞化学染色、血涂片细胞形态。
归入“分类不明”的细胞不宜过多。
涂片中血小板数减少的患者，要排除标本凝固的可能性。
【第二部分】细胞化学染色
细胞化学染色（Cytochemical stain）是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对细胞内的各种化学物质（包括酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。
【临床应用】：
①辅助判断急性白血病的细胞类型。不同细胞系列，其所含的化学物质成分、分布及含量各有不同；且随着细胞的逐渐成熟，化学物质的成分、含量等发生相应的变化。根据细胞化学染色结果不同，可推断细胞所属系列。仅从细胞形态学观察白血病的诊断正确率约50～70%，如结合细胞化学染色则可提到90%以上。
②辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。因为血细胞在病理情况下，其化学物质成分及含量会发生改变，以辅助疾病的诊断，如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。
【基本方法】
细胞化学染色因种类不同，染色步骤不同，但基本步骤为固定、有色沉淀反应及复染。
1、固定：
为了保持细胞结构及化学成份的不变，需对细胞进行固定。根据染色的成份不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。固定的方法有物理法和化学法，临床上常用的是化学法固定。
物理法包括干燥和火焰固定；化学法包括蒸汽固定和液体固定，如甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等。
①蒸汽固定：甲醛是一种常用的固定剂，甲醛极易挥发、氧化，故常用40%甲醛进行蒸汽固定。即在较封闭的玻璃器皿中加入40%甲醛，将涂片血膜朝下，固定5～10min。
②液体固定：将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可用两种或两种以上固定液混合而成，如10%甲醛甲醇液、甲醛丙酮缓冲液等。
2、有色沉淀反应：
通过不同化学反应，使被检测的化学物质最终形成稳定的有色沉淀。列举以下三种化学反应：
①偶氮耦联法：含萘酚的底物，在相应酶的作用下释放出萘酚，萘酚与重氮盐结合，偶氮偶联形成相应颜色的沉淀物。如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。
②普鲁士蓝反应：细胞内、外的铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成如亚铁氰化铁蓝色沉淀，如铁染色。
③雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘酸-雪夫反应。
3、复染：
目的在于使各种细胞能显示出来便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果。如铁染色复染常用中性红，过碘酸-雪夫反应常用甲基绿。对核着色效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等，使浆着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。复染后，首先要通过显微镜观察染色是否成功（如过氧化物酶染色、过碘酸-雪夫反应等可观察中性成熟粒细胞是否呈强阳性），然后观察染色结果并报告结果，结果报告一般包括阳性率、阳性积分（也称为阳性指数）或阳性分布情况。
一、铁染色
【原理】
健康人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。铁染色（ferric stain）化学反应过程如下：
【正常血细胞的染色反应】：骨髓中的贮存铁分为细胞外铁和细胞内铁。细胞外铁主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中，细胞内铁是指存在于中幼红细胞、晚幼红细胞及红细胞中的铁（包括铁粒幼红细胞、铁粒红细胞）。
1、细胞外铁：观察骨髓小粒中的铁，阳性结果呈弥散性、颗粒状、小珠状或块状蓝色。根据骨髓小粒中铁的存在方式及量将细胞外铁分为（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。
2、细胞内铁：观察100个中幼红细胞和晚幼红细胞，计算出铁粒幼红细胞的百分比（即细胞内铁阳性率）。
铁粒幼红细胞是指胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞，根据蓝色铁颗粒多少、粗细分为：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型及环形铁粒幼红细胞。
Ⅰ型：幼红细胞内含铁粒1～2个。
Ⅱ型：幼红细胞内含铁粒3～5个。
Ⅲ型：幼红细胞内含铁粒6～10个。
Ⅳ型：幼红细胞内含铁粒11个以上。
环形铁粒幼红细胞：是指幼红细胞胞质内蓝色在5颗以上，围绕核周三分之一以上者。
成熟红细胞中出现铁颗粒称为铁粒红细胞。
【参考范围】
1、细胞外铁：（+）～（++），约2/3人为（++），约1/3人为（+）。
2、细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率在12%～44%。以Ⅰ型为主，少数为Ⅱ型。无环形铁粒幼红细胞及铁粒红细胞。不同的实验室其细胞内铁的参考值相差较大，所以要建立自己实验室的参考值。
【临床意义】
铁染色是临床应用最广泛的细胞化学染色之一，主要用于缺铁性贫血和环形铁粒幼红细胞增多性贫血的诊断和鉴别诊断。
1、缺铁性贫血：其细胞外铁阴性，细胞内铁阳性率明显下降或为零。经铁剂治疗有效后，其细胞内铁、外铁增多。因此铁染色可作为诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。
2、铁粒幼细胞贫血：铁粒幼红细胞增多，其中的环形铁粒幼红细胞增多，有时可见到铁粒红细胞，细胞外铁也常明显增多。因此铁染色可作为诊断本病的重要方法。
3、骨髓增生异常综合征（MDS）：伴环形铁粒幼红细胞增多的难治性贫血，其环形铁粒幼红细胞大于有核红细胞15%，细胞外铁也常增加。
4、非缺铁性贫血：溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、多次输血后和白血病等，细胞外铁和内铁正常或增加；感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病等，细胞外铁明显增加而铁粒幼红细胞可减少。
【应用评价】
铁染色是临床上应用最广泛的一种细胞化学染色。铁染色的结果一般情况下是可信的，虽然该指标不如血浆铁蛋白敏感，但不受多种病理因素影响，所以说铁染色是反应机体储存铁的金标准。
1、假阳性：骨髓涂片受试剂、玻片清洁度及操作过程等因素的影响，涂片易被外界的铁污染，导致细胞外铁、细胞内铁增加或使阴性患者呈“阳性”；
2、假阴性：临床上导致细胞外铁假阴性的原因较少，通常是由于将标本凝块误认为是骨髓小粒所致。
二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）
【原理】
中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色的方法有Gomori钙-钴法和Kaplow偶氮耦联法。
Kaplow偶氮偶联法：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在pH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物，释放出萘酚，后者与重氮盐耦联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。不同的底物与重氮盐的组合不同。
【正常血细胞的染色反应】
NAP主要存在于中性成熟粒细胞胞浆内，故中性成熟粒细胞胞浆呈阳性，其他细胞基本呈阴性。在油镜下计数100个成熟中性粒细胞，分别记录其分级情况：（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++），分别为1、2、3、4分， 100个细胞中阳性细胞总数即为阳性率，100个细胞中阳性细胞的积分之和即为积分值。
例：
4分 占20％ 4 x 20=80分。
3分 占40％ 3 x 40=120分。
2分 占18％ 2 x 18=36分。
1分 占10％ 1 x 10=10分。
0分 占12％ 0 x 12=0分。
则阳性率88％ 积分=246分
【参考范围】
阳性率﹤40%，NAP的积分值为30～130分。
【临床意义】
不同疾病其NAP活性有变化。而且有些生理性因素可使酶活性发生改变，如应激状态、经前期、妊娠期、新生儿等可使NAP活性增加。
1、NAP积分增加：见于细菌性感染（包括类白血病反应）、再生障碍性贫血、某些骨髓增殖性疾病（如慢性中性粒细胞白血病、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症）、慢性粒细胞白血病（加速期、急变期）、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨髓转移癌、肾上腺糖皮质激素及雄激素治疗后等。
2、NAP积分下降：慢性粒细胞白血病慢性期、急性粒细胞白血病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等。
记忆技巧：不影响粒细胞分化成熟的疾病，其NAP是不可能降低的
【应用评价】
1、类白与慢粒的鉴别：前者增高，后者降低。
2、PNH与再障鉴别：前者减低，后者增高。
3、急性白血病类型鉴别：急粒NAP积分值减低，急淋NAP积分值增高。
由于本试验结果受影响的因素较多，如试剂、生理性波动及每个试验人员判断标准等，使结果相差较大，各单位应建立本实验室参考范围，NAP积分明显增高或明显下降，对疾病的诊断才具有重要的意义。
三、过氧化物酶染色（POX）
【原理】
血细胞所含的过氧化物酶（POX）主要为髓过氧化物酶（MPO），是人类中性粒细胞含量最多的一种蛋白质。POX的染色方法有多种，如复方联苯胺法、二氨基联苯胺法（DAB） 、四甲基联苯胺、改良的Pereira染色法等等。
二氨基联苯胺法的原理为：血细胞内的POX，能分解H2O2而释放出新生氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于POX酶所在的活性部位。
【正常血细胞的染色反应】
1、粒细胞系统：分化差的原始粒细胞为阴性，分化好的原始粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性；且随着细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强。嗜酸性粒细胞阳性最强，嗜碱性粒细胞阴性。
2、单核细胞系统：大多数细胞呈阴性或弱阳性，阳性颗粒少而细小。
3、其他细胞：淋巴细胞系统、红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性，浆细胞、组织细胞也呈阴性，吞噬细胞有时呈阳性。
【临床意义】
POX染色是辅助判断急性白血病细胞类型的首选、最重要的细胞化学染色。
1、急性淋巴细胞白血病：原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞均呈阴性。但实际上急性淋巴细胞白血病患者骨髓中可残留少许的原始粒细胞，而出现“原始淋巴细胞”呈阳性的现象，故FAB分型规定急性淋巴细胞白血病患者POX的阳性率＜3%。
2、急性粒细胞白血病：原始粒细胞阳性或阴性，但常阳性，为（+）～（++），阳性颗粒一般较多，颗粒较粗大，局灶性分布。
3、急性早幼粒细胞白血病：早幼粒细胞呈强阳性，为（+++）～（++++）。
4、急性单核细胞白血病：原始单核、幼稚单核细胞多数呈阴性或弱阳性，其阳性颗粒少而细小，分布弥散。
5、急性粒单核细胞白血病：原始单核、幼稚单核细胞呈阴性或弱阳性，原始粒细胞呈阳性或阴性。
6、急性红白血病：原始粒细胞呈阳性或阴性，原始单核细胞呈阴性或弱阳性，有核红细胞呈阴性。
7、中性成熟粒细胞POX活性下降，见于骨髓增生异常综合征、放射病、退化的中性粒细胞及某些白血病等。
小编注：上图取自@协和检验_张时民 教授的新浪微博
【应用评价】
POX染色是急性白血病形态学分型中最重要、首选的常规细胞化学染色。观察POX染色的关键是如何辨认哪种细胞是白血病细胞，由于POX染色片子中的细胞结构不如瑞氏染色下清楚，而且阳性细胞中已有阳性颗粒的覆盖，在一定程度上干扰了白血病细胞的辨认，所以其POX阳性率高低与实际真值之间会有一定的误差。同时，由于存在着杂质的沉淀，会出现假阳性，此时往往其他细胞和背景上也有阳性颗粒；
试剂失效，可导致假阴性，如果片中中性成熟粒细胞呈强阳性，即可排除试剂失效。
由于POX染色测定MPO的敏感性明显低于流式细胞术对MPO测定。所以， POX染色阴性的患者并不等于白血病细胞中不存在着此酶，需用流式细胞术进行确认。
【补充】
苏丹黑染色（SBB）的染色结果与临床意义基本同POX染色 ，但其灵敏度及特异性两者有所不同。SBB染色的特异性低于POX染色，POX阳性见于髓系细胞，而SBB阳性也可见于淋系细胞；但SBB染色的敏感性高于POX染色，例如急性粒细胞白血病POX染色阴性的患者，其SBB染色可阳性。
由于SBB与POX染色意义相似，临床上通常只选择其中一种。因为细胞化学染色的特异性比敏感性重要，所以临床上选用POX染色，如患者POX染色阴性者可再加做SB染色或直接采用细胞免疫分型来确认。
四、过碘酸-雪夫反应（PAS）
【原理】
过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基（-CHOH-CHOH）的多糖类物质（糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖酯等）氧化，形成双醛基（-CHO-CHO）。醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使无色的品红变成紫红色化合物，定位于含有多糖类的细胞内。过碘酸-雪夫反应（PAS）以前又称为糖原染色。
【正常血细胞的染色反应】
1、粒细胞系统：分化差的原始粒细胞阴性，分化好的原始粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应，并随着细胞的成熟而逐渐增强，阳性呈弥散性、细颗粒状；嗜酸性粒细胞中的嗜酸性颗粒本身不着色，而颗粒之间的胞质呈红色；嗜碱性粒细胞中的嗜碱性颗粒呈阳性，而颗粒之间的胞质不着色。
2、红细胞系统：有核红细胞及红细胞均呈阴性。
3、单核细胞系统：分化差的原始单核细胞呈阴性，其他阳性，绝大多数阳性呈细颗粒状，有时分布于细胞边缘的阳性颗粒较粗大。
4、淋巴细胞系统：大多数呈阴性，少数呈阳性（阳性率常小于20％），阳性呈粗颗粒状或块状。
5、巨核细胞系统：巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应的程度随细胞的发育成熟而增强，成熟巨核细胞多呈强阳性，阳性反应物质呈颗粒状或块状。
6、其他细胞：少数浆细胞阳性，巨噬细胞可阳性，两者均呈细颗粒状。
【临床意义】
1、红细胞系统疾病：红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中有核红细胞可阳性（呈均匀红色或块状），有时有核红细胞阳性反应强且阳性率高，甚至红细胞也呈阳性。某些红系良性疾病，如缺铁性贫血、地中海贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血、其他溶血性贫血中的有核红细胞有时也可呈阳性；巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血、其他溶血性贫血中的有核红细胞常呈阴性，个别细胞可呈阳性但反应弱。
2、白细胞系统疾病：主要用于辅助鉴别急性白血病的细胞类型，因为不同细胞类型急性白血病其阳性反应可不同。
①急性巨核细胞白血病时部分巨核细胞阳性，呈粗颗粒状、小块状或弥散分布；
②急性粒细胞白血病时部分原始粒细胞呈阳性，呈细颗粒状或弥散分布；
③急性单核细胞白血病时原始单核及幼稚单核细胞可呈阳性，阳性呈细颗粒状，有时胞质边缘处颗粒较粗大。
④急性淋巴细胞白血病时原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞的阳性率升高，呈粗颗粒状或小块状阳性；
⑤慢性淋巴细胞白血病时淋巴细胞的阳性率增加，呈粗颗粒状或小块状；
⑥恶性淋巴瘤时淋巴瘤细胞阳性率高、阳性增强，呈小块状或粗颗粒状。
3、其他细胞：戈谢（Gaucher）细胞呈强阳性，尼曼-皮克（Niemanm-Pick）细胞胞质空泡呈阴性，而空泡之间的胞质呈阳性；Reed-Sternberg细胞阴性或弱阳性；骨髓转移性腺癌呈强阳性。
【应用评价】
PAS染色在诊断恶性红细胞系统疾病中最有价值（尤其是强阳性，意义更大），但有时也呈阴性，所以阴性不能排除恶性红系疾病的可能性；而在大多数良性红系疾病中常呈阴性，但少数患者也可出现阳性。
在急性白血病中，如果的PAS染色结果典型，可辅助细胞系列判断，但是实际上PAS染色结果常不典型。PAS染色受试剂等影响，也可出现假阴性或假阳性。
五、酯酶染色
不同血细胞中所含酯酶的成分不同。根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶（SE）和非特异性酯酶（NSE）。特异性酯酶就是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）染色；非特异性酯酶的种类有多种，根据pH值不同分为酸性、中性和碱性酯酶，包括了酸性非特异性酯酶（酸性α-醋酸萘酚酯酶）、碱性非特异性酯酶（α-丁酸萘酚酯酶（α-NBE））和中性非特异性酯酶，后者包括α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE） 、醋酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DAE）等。目前显示血细胞中酯酶的方法均采用偶氮耦联法。
（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色
【原理】
血细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐耦联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞、其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”。
【正常血细胞的染色反应】
1、粒细胞系统 ：分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的原始粒细胞呈阳性，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性，但酶活性并不随着细胞的成熟而增强。嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性。
2、单核细胞系统：绝大多数为阴性，仅个别单核细胞系统细胞呈弱阳性。
3、其他细胞：如淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核红细胞、血小板等均呈阴性，肥大细胞阳性。
【临床意义】
主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型，是急性白血病的常规细胞化学染色。
①急性粒细胞白血病时原始粒细胞呈阳性或阴性，所以染色结果为阴性者不能排除急粒可能性；
②急性早幼粒细胞白血病时早幼粒细胞呈强阳性；
③急性单核细胞白血病时原始单核及幼稚单核细胞几乎均呈阴性，个别细胞弱阳性；
④急性粒-单核细胞白血病时原始粒细胞及早幼粒细胞呈阳性，原始单核及幼稚单核细胞呈阴性；
⑤急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病均呈阴性。
【方法评价】
NAS-DCE是粒细胞的特异性酯酶，它是急性白血病形态学分型时常规要做的细胞化学染色，尤其有助于POX阳性的急粒及急单的鉴别。
该实验敏感性较POX低，如有一定数量白血病细胞NAS-DCE染色呈阳性，可以肯定白血病细胞中有粒系成分；如果均阴性则不能排除有粒系成分的可能性。
观察NAS-DCE染色的关键是辨认白血病细胞，其阳性率高低与实际真值之间会有一定的误差（片中细胞种类越多误差就越大）
同时该试验存在着假阳性、假阴性的现象，假阳性主要是由于试剂质量等原因导致阳性颗粒出现在背景及阴性的细胞上，假阴性主要是试剂失效，导致所有细胞（包括中性成熟粒细胞）均阴性。所以观察结果时，可通过相应的方法排除这些因素的影响，NAS-DCE染色白血病细胞阳性对诊断粒系是可靠的。
（二）α- 醋酸萘酚酯酶染色
【原理】
α- 醋酸萘酚酯酶（α-NAE）存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，是一种中性非特异性的酯酶。血细胞内的α-NAE在pH中性条件下，水解基质液中的α- 醋酸萘酚并释放出α-萘酚，进而与基质液中的重氮盐耦联形成不溶性有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。单核细胞系统的阳性可被氟化钠抑制，所以做α-NAE染色时，通常同时做氟化钠抑制试验。
【正常血细胞的染色反应】
1、单核细胞系统：分化差的原始单核细胞呈阴性，分化好的原始单核细胞呈阳性（常较强），幼稚单核及单核细胞也呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。所谓抑制是指氟化钠试验的抑制率大于50% 。
2、粒细胞系统：阴性或阳性，但阳性反应不能被氟化钠抑制。
3、淋巴细胞系统 多数阴性，少数弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。
4、其他细胞：巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；少数有核红细胞呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆细胞呈阴性。
【临床意义】主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型。
①急性单核细胞白血病中的细胞大多数呈阳性且较强，阳性反应能被氟化钠抑制；
②急性粒细胞白血病中的原始粒细胞呈阴性或阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；
③急性早幼粒细胞白血病中的早幼粒细胞呈强阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；
④急性淋巴细胞白血病中的原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞呈阴性或阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。
⑤急性粒-单核细胞白血病中的原始粒细胞呈阴性至阳性，阳性反应不被氟化钠抑制；原始单核及幼稚单核细胞呈阳性且较强，阳性反应能被氟化钠抑制。
【评价应用】
α-NAE染色是急性白血病形态学分型时常规要做的细胞化学染色。对单核细胞白血病与粒细胞白血病鉴别意义较大。一般来说α-NAE在急性单核细胞白血病的阳性较强，但M3或M2b也呈强阳性。
本试验存在假阳性、假阴性的现象。假阳性主要是由于试剂质量等原因导致阳性颗粒出现在背景及阴性的细胞上，并可导致氟化钠被抑制的假象；假阴性主要是试剂失效，导致所有细胞（包括中性成熟粒细胞）均阴性。抑制率的计算应以阳性指数来计算比较合理。由于实验影响因素较多，应区别对待α-NAE染色。一般来说如果阳性较强且被氟化钠明显抑制，可以肯定其临床意义；对于抑制不明显的标本，结果的判断容易受主观等因素的影响，只能作为参考指标。
【补充】
1、醋酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DAE）染色与α-NAE染色属于同一类细胞化学染色，这两者的染色反应、临床意义和应用评价基本相同，临床上通常选择其中一种。
2、α-丁酸萘酚酯酶（α-NBE）染色的临床意义与α-NAE染色的临床意义、方法学评价基本相同。α-NBE敏感性不如NAS-DAE，而特异性较NAS-DAE高，所以α-NBE染色也是急性白血病常用的细胞化学染色。α-NBE染色也存在着假阴性和假阳性。
（三）酯酶双染色
在同一张涂片上进行两种酯酶染色的方法称为酯酶双染色。一般采用一种特异性酯酶加一种非特异性酯酶染色，故常用的有α-醋酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色、α-丁酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色等。
反应的原理基本上同各自的染色原理，但同一张涂片上的血细胞要分别在两种不同的基质液中作用一定时间，最后复染、显微镜观察。酯酶双染色对诊断急性粒-单核细胞白血病的诊断具有独特的价值，即在同一张片中出现两种酯酶染色阳性的细胞或同一种细胞同时出现两种酯酶染色阳性结果。
六、酸性磷酸酶染色（ACP）
【原理】
酸性磷酸酶（ACP）存在于细胞的溶酶体颗粒中，有些细胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。染色方法有偶氮耦联法和Gomori硫化铅法，前者常用。
偶氮耦联法：血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（pH5.0）条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与基质液中的重氮盐耦联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为六偶氮付品红，形成红色的沉淀。
【正常血细胞的染色反应】
所有血细胞的酸性磷酸酶染色均为阳性，但是单核细胞、组织细胞、巨核细胞和毛细胞反应较强。
【临床意义】 主要用于下列疾病的辅助诊断和鉴别。
1、多毛细胞白血病 多毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被L-酒石酸抑制。慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也可呈阳性，但可被L-酒石酸抑制。但ACP阴性者，并不能排除多毛细胞白血病的可能性 。
2、鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞 前者阳性，后者阴性。
3、T淋巴细胞和B淋巴细胞 前者阳性，后者阴性或弱阳性。
【应用评价】
由于ACP染色在多毛细胞白血病中最具有特征性，所以主要用于多毛细胞白血病的诊断，其次是在戈谢病和尼曼-匹克病应用。这些疾病在临床上均很少见，故常因为标本很少而导致试剂过期，因此临床上往往不能及时开展此项检查。该染色也存在着假阴性、假阳性现象。
七、小结
急性白血病分为急性淋巴细胞白血病（简称急淋，ALL）和急性髓细胞白血病（包括M0、M1、M2a、M2b、M3、M4、M5、M6、M7）。由于急性白血病骨髓中是以原始和/或幼稚细胞增生为主，仅仅根据瑞氏染色下的细胞形态，容易做出错误的判断，因此不论急性白血病细胞形态学表现是否典型，均应做细胞化学染色。建议急性白血病应至少做：过氧化物酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色及过碘酸-雪夫反应。
1995年发布的文献《急性白血病分型推荐流程》中，国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐以最少细胞化学染色组合(包括MPO、CE、a-NAE三种染色)为急性白血病实验诊断的首选细胞化学染色项目，如下图：
2008年发布的文献《国际血液学标准化委员会（ICSH）关于骨髓标本与报告标准化指南》中提到：如怀疑急性白血病，建议髓过氧化物酶染色和非特异性酯酶染色（如α-萘丁酸酯酶）。当无流式细胞学检查或流式结论不确定时，细胞化学染色特别有价值，如下图：
由于白血病细胞具有高度异质性，同一类型白血病在不同患者中，其细胞化学成分也不尽相同，经常会出现细胞化学染色结果不典型、摸棱两可或结果与形态结果不相符的现象，所以根据细胞形态学和细胞化学染色并不能对所有急性白血病的细胞类型做出正确的判断，还需要结合染色体检查、细胞免疫学检查及分子生物学检查等进行全面分析。
对于不明原因贫血的初诊患者，应当将铁染色作为常规检查项目，因为缺铁是导致贫血最常见的病因，同时还可以了解是否有铁代谢的异常。必要时还应做中性粒细胞碱性磷酸酶染色和过碘酸－雪夫反应，用于贫血辅助诊断和鉴别诊断。
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【第三部分】概括
骨髓细胞形态学检查是诊断血液系统疾病最重要的实验室检查项目，通过检查得出不同性质的诊断意见。骨髓检查的常规步骤为：骨髓取材→常规染色→低倍镜观察→油镜观察→计算结果→填写报告单→标本登记及保存。
细胞化学染色是以细胞形态学为基础，对血细胞内的某些化学物质进行分析的一种方法，细胞化学染色种类有许多，但其基本步骤为：固定→有色沉淀反应→复染。不同染色起着不同的作用，其中铁染色、NAP染色等有助于疾病的诊断，POX染色、特异性酯酶染色及非特异性酯酶染色等有助于判断急性白血病的细胞类型。
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