原发中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）是一种以特异性神经系统临床症状为主要表现的恶性疾病，95%以上的病理类型为弥漫大B细胞淋巴瘤。PCNSL预后差的原因之一是由于用于神系统外DLBCL治疗的传统R-CHOP 方案（rituximab, cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone）不能很好地透过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），因此目前PCNSL治疗中，仍以大剂量甲氨蝶呤（methotrexate）为基础，联合阿糖胞苷（cytarabine）、烷基化剂（alkylating agents）和利妥昔单抗（rituximab）等化疗药物的方案为一线治疗策略。尽管该治疗方案能够改善预后，但毒副作用明显且需住院治疗，比常规R-CHOP方案花费大。
如果能增强R-CHOP方案的中枢药物浓度，将对PCNSL病人带来以下利好：毒副作用低，耐受性好；无需住院，门诊化疗即可。既往研究发现，某些炎症因子，如肿瘤坏死因子（TNF），能够改善内皮细胞间黏附，促进BBB通透性，增强化疗药物的中枢浓度，从而杀伤肿瘤细胞。然而单纯TNF的运用导致了肿瘤患者难以承受的毒副作用，主要是由血管渗漏综合征引起的血流动力学不稳定、低血压甚至肺水肿。
为此，研究人员开发了CNGRCG-人TNF融合蛋白，简称NGR-hTNF（CNGRCG是一种肿瘤血管多肽，能够特异性识别肿瘤血管CD13分子，CD13分子特异表达于肿瘤血管，低/不表达于正常血管），使得极低剂量的细胞因子能够精确到达肿瘤血管，改善血管通透性，增强了肿瘤组织中化疗药物浓度，且避免了系统毒副作用的发生。基于这些研究结果，本项临床研究旨在探索低剂量NGR-hTNF能否改善BBB，进而增强R-CHOP方案在复发/难治PCNSL中的治疗效果。
研究方案
该项单组2期临床试验主要包括两部分：（1）探索期，主要聚焦于NGR-hTNF/R-CHOP方案的可行性，通过收集首批10位受试对象的试验数据，评估NGR-hTNF对肿瘤血管通透性影响及是否增加R-CHOP药效浓度，为后续试验提供证据支持；（2）延展期，应用NGR-hTNF/R-CHOP方案对所有纳入对象进行临床试验。
受试对象纳入标准：(1) 组织学诊断为DLBCL；(2) 病灶仅局限于CNS， 脑神经、脑脊膜和/或眼睛；(3)经大剂量MTX治疗后复发或经大剂量MTX治疗无效; (4)可检测疾病; (5)年龄在18-80岁间; (6) ECOG评分≤3.
排除标准：曾接受过器官移植或其它形式的免疫抑制状态；HBV、HCV和/或HIV感染；患其它恶性疾病。
试验设计和处理：首批10位受试对象进行探索期研究，流程见图1，即先单独进行1个无NGR-hTNF处理的R-CHOP疗程作为对照，剩余5个R-CHOP疗程前都先注射NGR-hTNF（R-CHOP前2小时0.8 μg/m2注射）；延展期研究中，所有受试对象进行6个疗程NGR-hTNF处理后R-CHOP方案治疗，收集相应数据；NGR-hRNF输注前30至60分钟患者口服或静脉用1000mg对乙酰氨基酚用于预防输注相关反应。受试对象6个疗程治疗后达到完全 (CR) 或 部分 (PR) 缓解后会再次评估进行后续巩固治疗，根据前期治疗方案，可选择30-36 Gy的WBRT、卡莫司汀/塞替派处理后的ASCT或口服来那度胺。
毒性和反应评估：每一治疗过程独立进行毒副反应评估，包括心电图、肌钙蛋白测定、超声心动图等对心脏毒性监测；所有受试对象进行治疗反应评估，治疗反应通过连续2次增强MRI检测，详见图1；根据国际原发CNS淋巴瘤委员会制定的标准定义治疗反应，即CR：淋巴瘤所有症状消失；PR：肿瘤大小缩小50%；PD (progressive disease)：肿瘤大小增加25%或监测到新病灶;
BBB通透性评估：通过DCE-MRI和SPECT成像检测；
肿瘤血管CD13表达检测：NGR-hTNF能够靶向识别肿瘤血管CD13，本实验中通过免疫组织化学技术和免疫荧光技术检测肿瘤血管CD13的表达情况。
外周血和CSF中药物浓度检测：根据图1所示流程进行血浆和CSF采集，通过酶联免疫吸附实验（Elisa）检测rituximab；液相色谱串联质谱法测定cyclophosphamide、doxorubicin等药物浓度。
图1.试验设计
研究结果
纳入对象：12个受试对象中位年龄61岁（41-68），入组时11个患者具有中高危险IELSG评分，7个患者ECOG评分≥2，6个患者血清LDH增高，6个患者脑脊液蛋白水平升高，5个患者为深部脑实质受累，所有患者均具有脑实质损伤，1个患者伴有眼部病灶。无脑膜受累患者。所有患者均经过充分治疗，7个患者曾接受过2线以上治疗，10个患者曾接受ASCT、WBRT或两者均有，7个患者为难治病例。详细资料见表1。
可行性和毒性：受试实验方案耐受良好，9个患者进行了6个疗程治疗，3个患者因为疾病进展而中断治疗，详见表2；所有受试对象未出现预料之外的毒性反应，均不需要药物减量，只有3个（5%）患者因为血细胞减少而推迟治疗，2个并发严重毒副反应的患者经治疗均有效缓解。
疗效：前10名入组患者单独接受了一个疗程没有使用NGR / hTNF的R-CHOP方案，治疗结束后，1名患者获得PR，7例病情稳定，2例出现PD；对于NGR-hTNF / R-CHOP联合方案，8例患者获得CR（图2），1例PR，ORR为75％（置信区间为95％，51-99）;3名患者经历过PD（图3）。有意思的是，一个进行单独R-CHOP治疗后PD的患者在进行了第二疗程NGR-hTNF / R-CHOP联合方案后获得了PR，4个疗程后疾病趋于稳定，并维持到6个疗程后；在第一阶段试验中，至少4例获得治疗反应的预期在首批12例患者中超额达成，最佳治疗反应出现在第二个疗程后有6例，4个疗程后有3例，所有最佳治疗反应均在6周后MRI复查鉴定；巩固治疗中，2例进行WBRT，3例进行ASCT，2例来那度胺维持治疗，2例为这些治疗的组合。
所有患者治疗反应持续＞6个月（中位数，10个月; 范围，7-14个月）。 6名患者在7至12个月时复发; 2例患者（患者＃2和＃10，图3）死于与进行性神经损伤相关的并发症，没有复发性淋巴瘤的证据。 4名患者存活，中位随访时间19个月（范围：14-28个月）。
图3.治疗反应和反应持续情况的swimmer plot图
神经影像评估BBB通透性：按照方案，在7例获得治疗反应且有可测量病灶的患者中评估血管通透性变化。7名患者在第1次和第2次疗程后获得可分析的疗效，而在完成6次化疗后只有1个患者的最佳治疗反应为PR，其他6名患者均为CR。DCE-MRI分析表明在第一次NGR-hTNF输注后血管通透性增加（图4），这种作用在病灶周围更加明显。在第一个R-CHOP（未进行NGR-hTNF）之后，对比增强区域的中位Ktrans值是23.5（6.8-98.8），第二个疗程（NGR-hTNF/ R-CHOP）后升至35.3（23.9-887.7; P =0.39）; 在7名分析的患者中有5名观察到NGR-hTNF/R-CHOP治疗后Ktrans值增加。在病灶区域，基线值（仅R-CHOP）较低（中位数，2.5;范围：0.4-3.9），在第二个疗程输注NGR-hTNF后显著增加到4.7（范围，2.2-37.7; P=.01）;这种增强效应在所有评估的7名患者中得到证实。在第6个疗程后评估的一个患者中，无论在增强区还是肿瘤周围区，其Ktrans值与第2疗程后记录的数值相似，这表明NGR-hTNF能够发挥持续效应。
图4.DCE-MRI评估的BBB改变
SPECT评估BBB通透性： SPECT结果证实了NGR-hTNF增加肿瘤和病灶周围区域血管通透性的能力。 定量分析表明，所有受试对象中的99mTc-DTPA阳性区域有所增加（图5），在大于等于30％99mTc-DTPA摄取量中，其中位体积在输注NGR-hTNF / R-CHOP前后分别为26 cm3（范围5-67 cm3）和40 cm3（范围，10-92 cm3）（P = .028）， 中位体积量增加45％，范围为14％至87％。
图5.一例患者NGR-hTNF/R-CHOP治疗3次后99mTc-DTPA摄取增加
肿瘤血管CD13的表达：免疫组织化学染色显示CD13在12名受试患者的诊断性脑活检标本中均有表达; 在多数患者中，染色血管显示出狭窄的管腔和不规则轮廓（图6A）。应用抗CD13多克隆抗体和抗a-SMA（血管外皮细胞标记物）抗体进行免疫组化和免疫荧光共聚焦分析显示，多数染色的血管缺乏血管外皮细胞层（图6B），提示可能是未成熟血管。更成熟血管的三维投影显示CD13在肿瘤血管的腔侧表达（图6C-D），当静脉应用时NGR-hTNF可以到达这些血管。
图6.CD13在肿瘤血管中的表达
CSF和外周血药物浓度：NGR-hTNF特异性地作用于肿瘤区域，这一现象提示这种药物并不改变每个疗程之前收集的血浆或基线样本浓度。正如预期一样，NGR-hTNF并不增加阿霉素和环磷酰胺的血药浓度，因为基线标本和各个疗程标本中的浓度都低于检测限，从第1到第6个疗程的每个疗程后收集的样品浓度是趋于稳定的（表3）。众所周知，rituximab具有很长的半衰期（长达80天），第1到6疗程中，rituximab的血药浓度是在逐渐增加的，从基础水平（从16.6 ± 14.1 ng / mL到73.6 ± 43.8 ng / mL）到峰值（从45.4 ± 17.0 ng / mL到110.2 ± 93.4 ng / mL）。 正如预期，doxorubicin 和 rituximab 在CSF样本中未检测，而检测到的cyclophosphamide，在NGR-hTNF处理后，其在CSF浓度和CSF /血浆浓度比均没有变化。
表3.血浆和脑脊液标本中阿霉素、环磷酰胺和利妥昔单抗的浓度
研究结论
在难治/复发的PCNSL患者中，低剂量NGR-hTNF可以影响血管通透性。NGR-hTNF能特异性增强肿瘤及病灶周边血管通透性，这种作用可以通过DCE-MRI、SPECT和血浆/CSF药物动力学研究进行检测。NGR-hTNF/R-CHOP治疗方案是可耐受且安全的，使12例患者中9例肿瘤病灶快速消退，具有积极治疗反应。同时，该试验也表现出一定的局限性，主要是样本量较小（n=12），需要后续前瞻性研究的进一步证据支持。
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