血管形成实验从原理到定量分析(2)

实验步骤

1. 准备内皮细胞

（1）以3B-11细胞为例，检测前两天将3B-11细胞传代。细胞传代次数很重要，当细胞在第2代和第6代之间时，血管形成效果最好。使用第2代之前或第10代之后内皮细胞会影响实验效果：

（2）细胞在含10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中培养24小时。

（3）实验前一天，血清饥饿3B-11细胞：

先从3B-11细胞中弃去培养基，加入含0.2% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养24小时。

2. 实验试剂准备

（1）基底膜提取物（basement membrane extract, BME）购自BD Biosciences公司，Cat Number为354230：

值得注意的是BME浓度因批次而变化很大。如果浓度低于10mg/ml，BME就不能很好工作，因此应该在购买之前联系代理商，以确保获得足够集中批次的试剂。

（2）BME小瓶使用前一天浸入置于4度冰箱的冰中过夜解冻，解冻后，旋转小瓶以确保混匀。融化后的基质胶在15℃以上，会迅速凝固，操作的时候放置在冰上，防止过早凝固。

此外，与基质胶接触的所有培养器皿、耗材和培养液均应预冷，整个实验过程需始终保持基质胶置于冰上。对融化后的基质胶进行分装，需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。

（3）用于信号通路研究时，低生长因子的BME（Reduced growth factor BME）比起传统的BME更可取，因为排除了生长因子的干扰。

3. 实验前内皮细胞的准备

（1）使用杜氏磷酸缓冲液（DPBS，和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子）清洗3B-11细胞，加入适量含EDTA胰蛋白酶消化细胞。

（2）培养基终止消化后使用100μm细胞滤网过滤细胞，去除结块。

（3）在含10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中计数细胞至最终浓度7.5x106个细胞/ml。所种细胞数也会影响血管形成效果，不同细胞类型密度需摸索：