干货 | 基于高分辨质谱定量技术的靶标代谢组学

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定量靶标代谢组学技术

靶标代谢组学是以标准品为参考，针对特定某一物质或一类代谢物进行检测的代谢组学方法，一般利用三重四极杆低分辨质谱MRM技术进行。但BIOTREE今天要介绍的是基于高分辨质谱PRM技术的靶标代谢组学。

为了更好的理解PRM技术，那我们就不得不先讲讲SRM/MRM技术了~

SRM/MRM(单/多反应监测 Single/multiple reaction monitoring）技术是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。

PRM技术（平行反应监测，Parallel Reaction Monitor ）是一种基于高分辨、高精度质谱（如Orbitrap系列）的离子监视技术。相比于传统的SRM/MRM技术，PRM技术将采集二级信息所用的四级杆质量分析器替换为更高分辨、更高质量精度的分析器，实现了从目标离子对检测到全部目标离子碎片检测的转化。因此，PRM技术不仅具有SRM/MRM的靶标定量分析能力，还同时具备了定性能力。

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PRM技术能做什么？

BIOTREE在运用PRM技术时，首先利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中（Q1）选择性地检测目标肽段/小分子的母离子信息；随后在Collision cell中对母离子进行碎裂；最后利用高分辨、高质量精度分析器（如Orbitrap系列）在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。这样即可对复杂样本中的目标肽段/小分子进行准确地特异性分析。

PRM定量分析的优势：

（1）质量精度达到ppm级，能够比SRM/MRM更好地排除背景干扰和假阳性，有效提高复杂背景下的检测限和灵敏度；

（2）对子离子进行全扫描，无需选择离子对和优化碎裂能量，更容易进行方法学建立；

（3）媲美MRM的线性范围。

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为什么要用PRM？

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物质验证更准确

当进行非靶标代谢组学结果验证时，由于色谱条件（色谱柱、流动相梯度等）与非靶保持一致，这样标品的出峰保留时间与原非靶的出峰时间理论上是一致的，这样就更能保证物质验证的准确性。

在PRM模式下，标准品是被采集了高分辨二级谱图的，通过与样品中的实际检出的二级谱图比对，可以更准确的确认目标化合物。

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特异性更好

相比MRM技术，PRM是将Q3换成了高分辨质量分析器（如Orbitrap）。高分辨质量分析器能够更好地分辨子离子，从而特异性更好。

MRM/SRM VS PRM

PRM中使用的高分辨质量分析器，如Orbitrap，最高可达几十万的分辨率，可以轻松区分离子。而MRM技术使用的是三重四极杆（QQQ）低分辨率质量分析器，对质荷比接近的离子区分不开。

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高灵敏度

PRM技术检测的样品可以低至10μL，有文献报道一次可检测408种代谢物，包括氨基酸、生物胺类、酰基肉碱以及脂类等。

另外，在诸如QE系列高分辨质谱仪中，由于其特有的C-trap模块能够富集离子从而提升灵敏度，使之拥有媲美三重四极杆质谱仪的灵敏度。

在定量计算方面，PRM技术与MRM技术一样，都需要采用标准品或稳定同位素内标建立标准曲线，从而保证定量结果的准确可靠。

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实例

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“Development and Evaluation of a Parallel Reaction Monitoring Strategy for Large-Scale Targeted Metabolomics Quantification”— PRM在大规模靶标定量代谢组学的开发与评估

文章摘抄自 Analytical Chemistry

文章采用PRM、MS1和MRM对不同类型样品的237个极性代谢物测量后，就PRM技术和MRM技术在动态范围、线性度、再现性和系统稳定性上做了详细对比。在该文章中PRM和MS1的分析定量采用的是Q——Exactive平台，MRM分析定量采用的是QTRAP 6500平台。

结果表明，PRM在监测237种极性代谢物上比MS1具有更高的再现性和定量准确度。此外PRM还表现出比在QTRAP 6500平台上采用的MRM技术有更好的灵活性和精准度。

图1.使用PRM技术的代谢组学策略概述。

（A）PRM技术样品分析的工作流程。（B）分别在Q-Orbitrap和QQQ仪器上进行的PRM（上）和MRM（下）示意图。母离子（如大的彩色圆圈）在Q1中选择，在Q2中以类似的方式碎裂。

图2.基于PRM、MRM和MS1的大规模靶标代谢组学定量方法的比较。

（A−C）使用不同分析方法对八种生物样品进行三次分析的变异系数（CV）分布。（D-F）使用不同方法分析八种生物样品的基于皮尔逊相关性的聚类热力图。行代表检测到的代谢物，列代表生物样品。颜色表示从低（蓝色）到高（红色）的代谢物浓度。（G-I）使用不同分析方法分析八种生物样品的主成分分析（PCA）得分图。

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“A Novel Strategy for Comprehensive Identification of Acylcarnitines Based on Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry”— 基于液相色谱-高分辨率质谱法的酰基肉碱综合鉴别新策略

文章摘抄自 Analytical Chemistry

“PRM can provide more confident identification for metabolites, and it has emerged as a potential alternative to MRM。”（译：PRM技术可以为代谢物提供更为可靠的鉴定，并且已经被作为MRM的潜在替代方案。）

文章针对研究需求，开发了一种基于液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）的新方法，以尽可能多的鉴定酰基肉碱。

文章采用了“分层递进策略”，即首先进行初始全扫描MS或数据依赖性MS/MS监测（ddMS²）采集，随后与PRM结合起来，去分析生物样本。

使用PRM技术，获得了733种可能的酰基肉碱特征性的高分辨率MS/MS特征峰（Features）信息。从而构建了包含精确质量数、保留时间和MS/MS信息的758个酰基肉碱数据库，这是迄今为止报道的最全面的酰基肉碱数据库。