中科院遗传发育所发表“重组菌群体系在根系微生物组研究中应用”的重要综述

植物根系为微生物提供大量聚集栖息和繁衍的场所。这些微生物及其相互关系统称为根系微生物组。根系微生物组伴随着植物的整个生长周期，帮助植物吸收营养、抵抗病害和适应胁迫环境。根系微生物组研究目前主要以描述性研究为主，重组菌群体系为研究根系微生物组与宿主植物互作的功能和机制提供了前所未有的机遇。

中科院遗传发育所白洋课题组应邀发表了根系微生物组研究中合成菌群体系的综述文章Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research。总结了合成菌群体系在植物根系微生物组功能研究中的应用。主要包括：一、分离培养根系微生物组菌种资源；二、比较主流植物无菌种植研究体系的优缺点；三、合成菌群体系在根系微生物组研究中应用的经典案例（重现自然土壤的实验结果，研究根系微生物组的功能，研究微生物与微生物之间的关系）。文章也指出当前研究方法的不足，展望了未来需要解决的问题。

白洋课题组长期进行植物与根系微生物组互作的研究，近期在Science、Nature Biotechnology 等杂志发表相关研究重要成果。该综述于2019年11月14日在线发表于Current Opinion in Microbiology 杂志(https://doi.org/10.1016/j.mib.2019.10.010)。工程师刘永鑫为该论文第一作者，白洋研究员为通讯作者，在读博士生秦媛参与了部分工作。该研究得到了中国科学院战略性先导科技专项、前沿科学重点研究项目、国家自然科学基金面上项目和中国科学院微生物组项目的支持。

根系微生物组研究中的合成群落还原法

Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research

Current Opinion in Microbiology [6.916]

2019-11-14，Review

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.mib.2019.10.010

摘要

合成群落(Synthetic community，简称SynCom)方法，是研究有关植物如何调控其微生物群落、以及微生物组如何影响植物生长和健康的功能和机理的有效手段。微生物的培养和重组在此过程中起着关键作用，这使研究人员能够在可控的实验室条件下可重复研究植物与大部分与植物相关微生物之间的相互作用。在这里，我们总结了在植物微生物组研究中使用SynCom实验的出现、当前的成就和未来的机会，关注的重点是与植物根相关的细菌。

引言

注：··代表强烈推荐的参考文献；·代表推荐的参考文献；参考文献部分也会对这些推荐文献进行简要介绍

独特的微生物组聚集在植物根部，微生物成员来自土壤环境[1··-3··]，详见《Nature: 拟南芥根微生物组的结构和组成》。这些微生物在其整个生命周期中与植物相互作用[4,5]，详见《水稻微生物组时间序列分析》，影响植物的生长[6,7··]，养分吸收[8··，9··]和抗病性[10··-13·]。在过去的十年中，已经在模式植物[1··，3··，14]和农作物[10··，15··-19]中广泛研究了根部微生物组的组成。此外，研究人员从各种植物的微生物群落中培养细菌并建立资源库，包括拟南芥、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）、马铃薯（Solanum tuberosum）、三叶草（Trifolium pratense）和甘蔗（Saccharum sp.）[8··，10··，18,20··，21··-23]等。培养这些细菌的最终目标是检查根系微生物群与宿主植物之间相互作用的功能和机理。在这里，我们讨论在实验性使用合成群落（SynComs）的主要挑战，即微生物组培养和重组。

从整体主义到还原主义

From holism to reductionism

根系微生物组与宿主植物之间相互作用的研究，架起了微生物生态学和植物分子生物学领域的桥梁。生态学研究通常使用整体方法研究根微生物组，这对于揭示自然环境中根微生物组的状态至关重要。相比之下，使用还原论方法的研究试图避免不可控制的变量，将根微生物组与植物宿主的相互作用分解为实验可控制的因素（培养的微生物，营养素，植物基因型等），以了解其功能和机制[ 24·]（图1）。两篇具有开创性的论文在根微生物学研究中率先提出了还原论的概念[1··，3··]。这些研究的作者在受控条件下和在天然土壤中生长拟南芥植物，以避免风，雨和温度的差异，同时允许植物从天然土壤微生物群落中组装根微生物组（图1a，b）。通过大量的生物学和技术重复，两项研究得出的结论是：与土体土壤的微生物组相比，拟南芥植物具有独特的根系微生物组。此外，Bulgarelli等证明了在实验室条件下天然土壤中根系微生物群的主要组装模式与自然田间土壤中的根系微生物群落相似[1··]。

在温室(受控条件)下研究天然土壤接种物中的根部微生物组的组装已广泛用于水稻，拟南芥及其近缘[15··，25·，26·]等物种的根部微生物组研究（图1b）。减少环境变化对于有意义的微生物组比较描述至关重要。但是，为了通过实验操作微生物组，必须将根微生物组和宿主植物之间的相互作用分解为实验可控制的因素，例如微生物、植物基因型、营养素和生长条件（图1c）。这要求研究人员培养特定的微生物[27]。

图1. 在田间、温室和实验室合成群落系统中开展微生物组研究

（a）田间实验用于探索自然条件下根系微生物组的组装和变异，温度，风，雨，微生物组和土壤养分等环境因素无法控制。

（b）在受控温室内使用天然土壤进行的实验可避免环境变化并提供可重复的结果。但使用此技术无法深入剖析微生物群成员和土壤养分。

（c）合成群落(SynCom)方法利用培养的微生物提供独特的机会以获得完全可重复的结果，并研究根部微生物组在植物适应性中的功能。

培养和剖析根系微生物组

Cultivating and dissecting the root microbiome

操纵微生物组的方法需要大量收集微生物培养物和植物无菌(axenic)生长系统[20··，28·，29··]。尽管成千上万的培养微生物已被分离并保藏在一些国际菌种保存中心[30]，但这些微生物是从各种环境或宿主物种中获得的，并且可能适应当地条件以及与天然微生物组的其他成分进行相互作用。因此，现有分离株可能与研究人员在其新样品中发现的微生物在基因型和功能上有所不同，因此可能不适合在给定的天然土壤中剖析植物与根部微生物组之间的相互作用。

高通量细菌培养为大规模捕获和操纵细菌群落提供了解决方案（图2a–d）。最近，白洋等建立了用于高通量细菌培养和鉴定的实验和分析流程，能够从在自然土壤中生长的拟南芥植物的根和叶中分离和鉴定了7943个细菌分离物[20··]。这项技术主要涉及使用TSB、R2A等相关培养基以及限制稀释方法，并辅以细胞分选和菌落挑选。使用基于454测序的方法的对细菌分离株进行了表征，这使作者能够鉴定出共同培养的菌株。该方法培养了可重复存在于拟南芥根和叶微生物组中细菌类群的50％以上。最近，张婧赢等人使用一种改进的鉴定方法鉴定来自水稻根的13,512种细菌分离株，覆盖了70％的水稻根细菌微生物组成员。这种新方法使用Illumina HiSeq2500提高了测序深度，并通过使用两端条形码标签(barcode)和每种分离物的独立文库制备避免了嵌合体形成，从而提高了鉴定的准确性[8··]。这些方法提供了一种剖析特定根微生物组样品的有效方法，其优点是能够识别共培养的细菌（即包含一种以上细菌的细菌“分离物”）。

为了获得尽可能多的多样性，有针对性的分离细菌（即，标准培养基不能满足特定培养要求的细菌）是对高通量细菌培养的有效补充。基于16S rRNA基因测序或鸟枪法宏基因组测序的几种方法可以帮助鉴定合适的专用分离培养基。例如，Oberhardt及其同事开发了一种工具KOMODO，详见《NC：16S序列预测培养基配方》，可以使用细菌16S rRNA基因序列来预测所需的分离培养基[31]。另一个可用的数据库中，使用Greengene ID，BugBase数据库可用于获取详细的细菌特征，例如有氧或无氧生长，从而为所需的培养条件提供指导[32]，详见《Bugbase预测16S扩增子数据表型》。宏基因组学数据或细菌基因组提供了有关细菌碳水化合物代谢和抗生素抗性基因的第二个信息来源，这有助于设计富集特定细菌的分离培养基[33,34]。在宏基因组学数据的指导下，Kwak及其同事使用含有卡那霉素的海洋肉汤培养基成功分离了22种具有番茄抗青枯病的黄杆菌的菌株[10··]，详见《NBT：根际微生物组抗番茄枯萎病 和 PPT思路梳理》。同时培养基制备技术也很重要，例如，Kato及其同事报告称，高压灭菌的磷酸盐和琼脂一起生成H₂O₂，从而减少了最终的菌落数[35]，详见《再这么配培养基，你的细菌都被毒死了！》。未来的培养工作应针对培养难以获得的分类单元（即酸性细菌，嗜弯曲杆菌，变形杆菌和厌氧分类单元），这些分类单元普遍存在于根系微生物组中，但在收集培养物中并未得到很好的体现。

SynCom实验中的首次通过表征和分离株的选择通常使用培养菌株的16S rRNA基因序列与微生物组分析数据进行交叉比对（图2e）。在微生物组分析中，与使用97％ 16S rRNA基因序列相似性聚类的操作分类单元（OTU）相比，在UNOISE、DADA2和Deblur分析（主流非聚类方法dada2,deblur和unoise3介绍与比较）中获得的扩增测序变体（ASV，100％16S rDNA序列相似性）提供了更高的分辨率，详见《扩增子分析还聚OTU就真OUT了》。ASV区分16S rRNA基因中的单核苷酸多态性。这样可以更精确地比较培养细菌和扩增子数据[36-38]；然而，应该指出的是，尽管16S rRNA基因是最广泛使用的分类标记，但并不能揭示细菌分离物中的所有基因组和功能变异。例如，Karasov及其同事证明了属于同一OTU的假单胞菌分离株（基于16S rRNA基因序列）在基因组含量和疾病表型水平上表现出明显的不同[39·]。因此，选择具有相同16S rRNA基因序列但从不同根系分离，代表不同定殖事件的细菌菌株，将增加培养的根系微生物组成员的功能多样性[8··，20··]，如《NBT封面：水稻NRT1.1B基因调控根系微生物组参与氮利用》中对不同品种来源的相同16S菌种序列各保留一个菌株。

图2. 合成群落工作流程

Figure 2. SynCom workflow.

a. 采集带有大量微生物组的植物根系

b. 采用挑单克隆、限制梯度稀释和流式细胞分选等方法分离单菌

c. 采用双向标签的建库方式采用Illumina对培养组进行高能量鉴定，同时对非冗余菌进行16S全长Sanger测序

d. 纯菌采用甘油冷冻保藏，构建的菌种库可与自然样品比对可用菌种的比例和相对丰度

e. 根据不同研究，主要依据菌种与实验设计的相关分析、网络分类及依赖分类学分布，来选择实验菌种

f. 功能分析。采用单菌或混菌的方法，在无菌体系中接种无菌苗，观察表型的变化以及定量群落结构的变化

植物无菌培养系统的比较

Comparison of axenic systems

SynComs主要使用三种无菌系统：琼脂基(agar-based)，黏土基质(clay-based)和FlowPot系统，每种系统都有各自的优缺点。琼脂系统是高度人工的，许多因素（如营养水平以及生物和非生物胁迫）均受到控制[40··-42]。与琼脂系统相比，基于粘土的系统可以更好地模拟土壤条件，因为粘土的质地类似于土壤。但是，粘土基质会影响养分状况影响，使其难以去除氮或磷酸盐等特定养分，并且粘土缺乏有机碳[8··，20··，43··]。FlowPot系统基于高压灭菌和洗涤过的土壤，因此含有有机碳。但是在该系统中，营养成分无法控制[7··，29··]。因此，系统的选择应基于实验的最终目的。

合成群落法重组根系微生物组

Reconstituting root microbiomes using SynComs

利用培养的纯菌株，科学家们能够根据自然微生物组模式在无菌系统中合成群落(SynComs)，该模式是通过微生物与植物表型之间的相关性获得的[10··]，以及野生型和突变体植物之间根系微生物群落的比较[ 43··]或网络分析[7··]（图2e）。这些方法为验证在自然土壤条件下观察到的根系微生物组装配模式、研究根部微生物组对不同环境条件下植物适应性的影响、研究微生物与微生物之间的相互作用、以及微生物基因功能提供了新的机会[44-46]（图2f）。

在无菌条件下使用SynComs可为研究人员提供可控的生态环境，其中可严格控制微生物、养分和植物基因型，产生可重复的结果，可用于对观察到自然土壤中根部微生物组模式进行验证。例如，与自然土壤或含有38个细菌菌株的煅烧粘土重组系统中生长的野生型植物相比，Lebeis及其同事检测到水杨酸信号突变体的拟南芥根微生物组发生了变化[43··]。SynCom实验中显示野生型和突变型植物丰度不同的七个细菌菌株中，有四个属于自然土壤中野生型和突变型植物丰度差异的科。因此，基于从自然土壤和实验室合成群落条件下获得的证据，作者得出结论：水杨酸介导的植物先天免疫信号通路在科水平上调节拟南芥根微生物组的组装[43··]。Castrillo及其同事采用了类似的逻辑，他们研究了磷酸盐饥饿途径对拟南芥根微生物组建立的影响[40··，41]。这些作者确定了天然土壤和使用木村培养基(Murashige & Skoog)琼脂平板进行的SynCom实验中，均表现为野生型植物和几种磷酸盐饥饿突变体之间差异的根部微生物组组成。

此外，SynCom利用测序培养细菌的方法提供了简单且可重现的系统，用于研究根代谢物（例如三萜，芳香酸，香豆素和camalexin）在复杂自然土壤中对根微生物组与宿主植物之间相互作用的作用[ 47··-49·-51]。总之，在受控条件下使用SynComs进行的实验可以验证根微生物组的装配模式，并补充了在自然土壤条件下根微生物组的研究。

用SynCom在无菌系统中接种无菌植物的主要好处是能够研究不同环境条件下根部微生物组的功能。例如，Duran及其同事在基于土壤的FlowPot系统中用不同的SynCom（包括细菌，真菌和卵菌）接种了无菌的拟南芥植物，并发现根细菌微生物组在天然土壤中保护拟南芥植物免受丝状真核生物（真菌和卵菌）的侵害[7··]。Castrillo及其同事在低磷酸盐条件下用SynComs接种了无菌植物，结果表明细菌接种显着增加了植物的磷酸盐饥饿反应，而磷酸盐饥饿途径的主要调控因子直接抑制了植物的先天免疫系统[40··]。此外，有研究表明少量的SynComs的特征足以预测微生物组在拟南芥对磷酸盐利用中的影响[41]。最近的一项后续研究表明，伯克霍尔德氏菌与植物竞争磷酸盐的利用，加剧了植物磷酸盐的饥饿[42]。张婧赢及其同事利用从籼稻和粳稻品种的微生物组中培养出来的细菌，发现水稻根系微生物组促进了植物对有机氮的利用[8··]，详见《NBT封面：水稻NRT1.1B基因调控根系微生物组参与氮利用》。基于对野生抗病和易感番茄品种根系微生物群的相关性分析，Kwak及其同事成功地培育了一种目标黄杆菌，并证明了将其接种到番茄根中后能增强抗枯萎病能力[10··]，详见《NBT：根际微生物组抗番茄枯萎病 和 PPT思路梳理》。培养的假单胞菌进行基因组分析，鉴定了脂肽的生物合成和群体感应是致病性和共生根细菌之间的主要基因组差异[46]，以及根际细菌逃避植物防御或诱导植物易感性所需的基因[44]。，45]。这些实例证明了SynComs或培养的微生物在阐明根微生物组在不同环境条件下对植物适应性的影响等方面的实用性。

培养的微生物和SynCom方法为探索微生物与微生物之间的相互作用和微生物基因功能提供了独特的机会。牛犇及其同事使用琼脂系统和由从玉米根部培养的七个细菌菌株组成的SynCom，显示出泄殖腔肠杆菌(Enterobacter cloacae)的去除导致玉米幼苗根部微生物群落结构的完全丧失，证明了微生物－微生物相互作用的重要性和微生物组中关键物种的存在[52]，详见《PNAS：人工构建玉米极简微生物组》。Duran及其同事对培养的根源细菌，真菌和卵菌进行了大规模的二元互作分析，发现细菌对丝状真核生物的生物防治活性是冗余的性状，可以维持根微生物组的相互平衡[7··]，详见《Cell ：根部微生物跨界的互作促进拟南芥生存》 。Levy及其同事发现，与Acidovorax的delta-Hyde1和VI型分泌系统（T6SS）突变体相比，野生型Acidovorax与大肠杆菌和6种细菌分离株共培养的存活率降低了10²-10⁶倍，表明Hyde和T6SS介导的抗菌活性可用于调控微生物组[21··]，详见《NG：微生物是如何适应植物的？评论文章 正文解读》。这些研究揭示了培养的微生物在剖析微生物与微生物相互作用中的价值。

结论

Conclusions

由于土壤环境的复杂性，当前的SynCom方法只能部分模拟自然条件。SynCom系统的低复杂性可能意味着缺少一些重要的微生物组成员或营养物质。然而，在进行微生物培养后使用SynComs在无菌系统中进行实验，这使我们能够阐明根系微生物组与植物表型之间的因果关系，并剖析微生物组成员在自然土壤条件下的相互作用。为了进一步揭示根部微生物组在植物生长和健康中的功能和机制，需要更多的培养微生物、基因组测序、改进的无菌苗种植系统以及对不同功能微生物组成员的系统研究。