蛋白翻译后修饰科普专题--走近N-糖基化

编者按：

糖基化作为生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，可发生在细胞50%-70%的蛋白质上，通过影响细胞识别、分化、黏附、信号转导、免疫应答等重要的生命活动影响多种疾病的发生。免疫性疾病、先天性糖缺陷在内的多达数十种的遗传性疾病以及肿瘤均与糖基化异常或糖苷酶缺失有关。本文，小编继续抛砖引玉简要总结一下糖基化修饰。

内容分为五个模块：

1. 糖基化修饰类型

2. N-糖基化修饰简述

3. N-糖链的合成、转移、修饰

4. N-糖基化蛋白富集与糖链释放

5. N-糖基化修饰功能简述

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糖基化修饰类型

由于在结构上，糖基化修饰具有宏观不均一性(一个蛋白质上有多个糖基化位点，甚至是不同类型的糖基化位点)和微观不均一性(同一糖基化位点上可以连接不同类型的多糖)，糖基化修饰研究相较于其他修饰更加困难。根据连接氨基酸残基不同，糖基化主要分为 N-糖基化（可细分为高甘露糖型、复合型、杂合型）、O-糖基化（研究比较多的是 O-GalNAc、O-GlcNAc）、C-连接糖基化、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚四大类型。不同的修饰类型功能有所不同，其中研究最多的是 N-糖基化，O-糖基化次之。本文简单介绍一下 N-糖基化修饰。

图1 N-糖基化修饰

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N-糖基化修饰简述

N-连接糖基化(N-linked glycosylation) 是一种新生肽链的共翻译或翻译后修饰方式，糖链通过与新生肽链中特定天冬酰胺（N-X-S/T,X≠P）的自由-NH₂ 基连接，所以将这种糖基化称为 N-连接的糖基化。N-糖基化的过程在内质网和高尔基体中进行。N-糖基化修饰主要包括 N-糖的合成、转移和修饰三个过程。N-糖的合成和转移在内质网中进行，其修饰过程在内质网和高尔基体中都存在。另外，植物和哺乳动物中 N-糖基化修饰存在差异^[1]。

图2 植物和动物的蛋白质 N-糖基化过程及差异^[1]

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N-糖链的合成、转移、修饰

合成：N-糖的合成起始于内质网膜胞质一侧，多萜醇（dolichol）首先经过磷酸化活化，随后在一系列糖基转移酶作用下形成一个具有2分子 N-乙酰葡糖胺，9分子甘露糖和3分子葡萄糖的寡糖链，形成三天线结构。

转移：寡糖基转移酶（oligosaccharyltransferase,OST）复合体将合成的寡糖链转移至新生肽链中特定的天冬酰胺（N-X-S/T,X≠P）上 。此天冬酰胺(N)所在的基序比较保守，天冬酰胺(N)的后一位氨基酸为除脯氨酸（P）以外的任意氨基酸(X)，后两位氨基酸主要是丝氨酸(S)与苏氨酸(T)，后两位也存在其他氨基酸的可能，不过很少。值得注意的是，并不是所有的 N-X-S/T,X≠P 基序都能发生 N-糖基化修饰。

修饰：进入高尔基体后，原来糖链上的大部分甘露糖被切除，但又由多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子，形成了结构各异的寡糖链。植物和哺乳动物中蛋白质的 N-糖基化模式不同，其差异主要出现在高尔基体阶段^[1]。根据五糖核心外围糖链的延长方式不同，N-糖基化修饰常分为三种类型：高甘露糖型、杂合型与复合型。

图3 N-糖基化类型

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N-糖基化蛋白富集与糖链释放

为了提高糖肽鉴定到的数目，在质谱检测糖肽前，一般需要针对糖肽进行特异性富集。

富集：

针对 N-糖基化修饰肽段的富集方法有很多，比如凝集素富集、硼酸亲和富集、亲水色谱 HILIC 富集、肼化学富集等^[2]。不同的富集方法，富集原理各有不同，各有优缺点，其中凝集素富集与 HILIC 富集应用比较多。

凝集素是一种对糖蛋白上的糖类具有高度特异性的结合蛋白，种类有很多，不同的凝集素能够专一性地识别特定的单糖结构、糖基序列或糖苷键，并与之可逆结合。不同的凝集素组合使用，可以实现全糖蛋白/糖肽的富集。HILIC 富集采用极性固定相和非极性流动相的色谱技术，利用糖肽和糖链的亲水性进行分离。

糖链释放：

纯化后的糖蛋白样品即可进行糖链释放，多糖释放一般有酶释放和化学释放两种方法。酶释放法动物样本常用肽 N- 糖苷酶F(PNGase F)，PNGase F 可以将糖链从天冬酰胺上切除，同时可以使天冬酰胺转变为天冬氨酸，造成相对分子质量增加0.9847 Da，若是在重水中，引入 O¹⁸，增加2.9847Da，从而起到质量标记 N 糖基化位点的作用。化学法主要是肼解法，此法反应条件比较剧烈，会破坏糖链自身结构，而且蛋白部分已经破坏，无法进行糖基化位点的相关研究。

图4 凝集素富集，PNGase F 释放，质谱检测流程图

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N-糖基化修饰功能简述

N-糖基化修饰对于蛋白质的正确折叠、功能定位、胞内运输等起着重要作用，在哺乳动物中，N-糖基化对于调节胚胎发育^[3]、癌症发生发展和免疫防御等具有重要意义。在植物中，N-糖基化对于细胞壁的形成^[4]、生殖发育^[5]和抵御病原菌入侵^[6] 等诸多生理过程具有重要意义。下面对 N-糖基化在免疫系统与肿瘤中的研究进行简述。

图5 N-糖基化蛋白质组的应用方向

蛋白质糖基化或聚糖影响免疫细胞和免疫分子的结构与功能,影响机体对抗原的应答反应。免疫系统中多数分子都是糖蛋白，如免疫球蛋白、细胞因子、补体、分化抗原、黏附分子和 MHC 分子^[7]。针对免疫系统分子的糖基化研究，比较适合疾病标志物研究。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)便是一种已被广泛应用于肝癌早期临床诊断的血清糖蛋白。免疫球蛋白 G(IgG)是机体抗感染免疫的主力抗体，IgG 的糖基化修饰会影响其与 Fc 受体或补体 C1q 结合，进而影响 IgG 的生物活性及生物学功能^[8]。该蛋白质在不同的生理和病理条件下，糖基化修饰会发生改变^[2,8]，比如，风湿性关节炎(RA)--IgG 半乳糖及唾液酸残基减少^[9,10]；免疫介导性骨质疏松--唾液酸残基减少^[11]；胃癌--半乳糖及唾液酸减少，核心岩藻糖增加^[12,13]…

图6 人源 IgG 的不同水解片段上的糖链分布^[8]

糖基化可以调控肿瘤的增殖、侵袭、转移和血管生成^[14,15]，糖基化异常常被认为是癌症的标志^[16]，FDA 批准的大多数肿瘤标志物都是糖蛋白或聚糖抗原^[17-19]。

N-聚糖支化的程度可以通过调节生长因子受体（EGFR，FGFR，PDGF 等）的活性和信号传导，进而影响肿瘤细胞的增殖 ^[20-23]。

正常细胞可以通过糖基化受体和聚糖结合蛋白之间的相互作用调节凋亡机制，癌细胞可以破坏此机制从而逃避死亡^[24,25]，比如，在正常细胞中 GD3 的增加通常会诱导细胞凋亡，但在胶质母细胞瘤中，在 GD3 末端唾液酸中添加乙酰基会使 GD3 无法诱导细胞凋亡，从而促进肿瘤存活^[26]。

糖基化可以以各种途径影响肿瘤的侵袭与转移。癌细胞通常具有高水平的唾液酸化 ^[27]，唾液酸化作用的增加会增加局部负电荷，从而物理破坏细胞间粘附，并通过静电排斥促进从肿瘤块中脱离增强肿瘤细胞的侵袭^[28]。亦可通过影响跨膜糖蛋白 E-钙黏着蛋白的 N-聚糖链结构导致其蛋白定位错误进而影响肿瘤细胞粘附^[29,30]。

总体而言，癌症进程中的遗传、表观遗传、代谢、炎性和微环境机制改变与糖基化修饰改变密切相关，对这些聚糖修饰的深入研究将进一步有助于解释癌细胞相互作用、细胞外通讯（包括细胞外囊泡和胞外通讯）和癌症免疫^[31]。

图7 聚糖在癌症发展和进展中的作用^[31]

N-糖基化浅谈至此，敬陈管见。糖基化在生命领域的奥秘，仍有待广大科研工作者去追寻～