大量研究报道外泌体携带lncRNA参与调控肿瘤进程，然而lncRNA是否参与调控外泌体的分泌，还鲜有报道。今年三月，Dr. Liang Yang等人在杂志《molecular cancer》上发表了一篇题为“Long non-coding RNA HOTAIR promotes exosome secretion by regulating RAB35 and SNAP23 in hepatocellular carcinoma”的文章，揭示了在肝癌发展过程中，长链非编码RNA HOTAIR如何调控外泌体分泌。研究验证了lncRNA HOTAIR在促进肝癌细胞外泌体分泌方面的新功能，并为lncRNA在肿瘤细胞生物学中的应用提供了新的理解。
背景：最新的证据表明肿瘤细胞在肿瘤发生过程中释放大量的载物外泌体。外泌体分泌是一个由某些相关分子调控的多步骤过程。长链非编码RNAs（lncRNA）在肝癌细胞（HCC）发展过程中起了重要作用。然而，lncRNA HOTAIR在调控肝癌细胞外泌体分泌中起到的作用尚不清楚。
方法：本研究使用基因集富集分析法（GSEA）分析HOTAIR表达和外泌体分泌相关基因之间的关系。纳米颗粒追踪分析被用于验证HOTAIR对外泌体分泌的影响。通过透射电镜观察HOTAIR过表达后多泡体(MVBs)的转运，并用共聚焦显微镜对突触体相关蛋白23 (SNAP23)的簇决定子63 (CD63)进行分析。采用共聚焦共定位分析、磷酸化作用分析和解救实验，评估HOTAIR管控Ras相关蛋白质Rab-35（RAB35）、囊泡相关膜蛋白3（VAMP3）和SNAP23的机制，
结果：我们在HOTAIR高表达组中发现了外泌体分泌相关基因的富集。HOTAIR通过诱导MVB转运到质膜促进外泌体的释放。HOTAIR调控RAB35的表达和定位，从而控制对接过程。而且HOTAIR通过影响VAMP3和SNAP23共定位促进融合的最终步骤。此外，我们验证了HOTAIR通过mTOR信号诱导SNAP23磷酸化。
结论：本研究验证了lncRNA HOTAIR在促进肝癌细胞外泌体分泌方面的新功能，并为lncRNA在肿瘤细胞生物学中的应用提供了新的理解。
1.HOTAIR的异常表达与外泌体分泌蛋白的相关性
最近的证据表明，外泌体的分泌是一个由某些相关分子调控的多步骤过程。研究者之前的综述已总结了一系列参与外泌体分泌的调节因子。然而，lncRNA HOTAIR与外泌体分泌之间的关系却知之甚少。为研究HOTAIR和外泌体分泌相关基因之间的关系。作者从TCGA下载374例肝癌基因表达数据，并将数据分为两组：HOTAIR高表达组和低表达组。通过GSEA方法发现外泌体分泌相关蛋白显著富集到HOTAIR高表达组。a 热图显示了31个外泌体分泌相关基因在TCGA产生的374例肝癌中相对表达量，按HOTAIR中值表达分为亚组。右侧列表显示了31个与外泌体分泌有关的基因。 b富集图显示HOTAIR高表达组外泌体分泌相关基因富集。c-e分析肝癌组织中RAB35、SNAP23和VAMP3的 mRNA表达情况，并与正常组织比较。 f-h 分析HOTAIR相对高组与相对低组RAB35、SNAP23和VAMP3的 mRNA表达情况。t检验 * p值< 0.05 2.验证HOTAIR促进外泌体的分泌
a–c采用a透射电镜、b 蛋白免疫印迹和c NTA检测HepG2细胞分离的外泌体。 d HOTAIR对HepG2细胞外泌体释放的影响的NTA分析。数据以三个独立实验的均数±标准差(SD)表示，t检验 * p值< 0.05 3.HOTAIR增强了MVBs向质膜的转运
在外泌体分泌到细胞外环境之前，外泌体被包含在多泡体（MVBs）中，MVBs沿着微管运输到质膜。a pcDNA3.1-HOTAIR转染后HepG2细胞中CD63(红色)的共聚焦显微镜分析。用DAPI染色细胞核。b pcDNA3.1-HOTAIR转染后HepG2细胞中CD63(红色)和SNAP23(绿色)的共聚焦共定位分析。矩形框表示CD63和SNAP-23共定位的小点状结构。 c电镜图像显示转染pcDNA3.1或pcDNA3.1- HOTAIR的HepG2细胞中的MVBs。红色箭头指示MVBs。4.HOTAIR调控RAB35的表达和定位为了进一步研究HOTAIR影响MVBs运动的分子机制，作者分析了Rab GTPase家族成员。以往的研究发现，多个Rab GTPases位于与MVBs相一致的亚细胞位置，介导MVB沿微管转运。作者之前的综述总结了参与外泌体释放的Rab GTPases，包括RAB5、RAB7、RAB11、RAB27a、RAB27b和RAB35。通过PCR筛选RAB35。
a HOTAIR过表达HepG2细胞中编码参与外泌体释放的蛋白的RAB5、RAB7、RAB11、RAB27A、RAB27B和RAB35 mRNA表达的Real-time PCR分析。 b 蛋白免疫印迹检测上述细胞中RAB35蛋白水平。 c pcdna3.1或pcDNA3.1-HOTAIR转染HepG2细胞后CD63(红色)和RAB35(绿色)共聚焦共定位分析。矩形框表示CD63和RAB35共域的小点状结构。 d采用RAB35抗体或对照IgG抗体对HepG2细胞进行RIP检测，采用real-time PCR检测HOTAIR共沉淀RNA的富集程度。 e pcDNA3.1-HOTAIR和si-Rab35共转染HepG2细胞后，细胞外泌体分泌的NTA分析。 数据以三个独立实验的均数±标准差(SD)表示，t检验 * p值< 0.05。 5.HOTAIR诱导 VAMP3 与 SNAP23的转运
当MVBs被转运到细胞膜时，它们必须与质膜融合，以外泌体的形式释放Ilvs,这个过程是由SNARE跨膜蛋白介导的。SNAP23是一个重要的质膜SNARE。 a pcDNA3.1-HOTAIR转染HepG2细胞后， SNAP23(绿色)的共聚焦显微镜分析。用DAPI染色细胞核。b pcDNA3.1-HOTAIR转染HepG2细胞后，VAMP3(红色)和SNAP23(绿色)共聚焦共定位分析。矩形框表示VAMP3和SNAP23共定位的小点状结构。 6.HOTAIR通过磷酸化SNAP23促进外泌体的释放
使用phospho -tag SDS-PAGE分析评估HepG2细胞中非磷酸化SNAP23的水平。a用pcdna3.1或pcDNA3.1-HOTAIR转染的HepG2细胞。 b 分别用雷帕霉素(Rapa, 50 nmol/L)或对照载体(DMSO)处理转染pcDNA3.1或pcDNA3.1- hotair的HepG2细胞。数据以三个独立实验的均数±标准差(SD)表示，t检验 * p值< 0.05总结作者的研究结果表明lncRNA HOTAIR在调节HCC细胞外泌体分泌方面具有重要作用。HOTAIR通过诱导MVBs向质膜的转运，促进外泌体的释放。HOTAIR调控RAB35的表达和定位，控制对接过程。此外，HOTAIR通过影响VAMP3和SNAP23的共域化和活性，促进了融合的最后一步。Fig. 7 拟建HOTAIR调节外泌体分泌的模型。HOTAIR通过诱导RAB35表达和定位到MVBs来加速MVB运输。此外，HOTAIR通过调节SNAP23的定位和磷酸化来促进MVB融合，形成SNARE复合物
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