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靶向蛋白质降解(TPD)为药物发现提供了前所未有的新机会。虽然蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术已经进入临床试验并改变了小分子药物的格局，但利用其他降解机制，特别是溶酶体途径的新降解技术已经出现，相关技术拓宽了可降解靶点的范围。
近日，复旦大学鲁伯埙教授、丁澦教授、费义艳教授以及华东师范大学邢栋教授共同在Chemical Society Reviews杂志上发表了题为“Emerging degrader technologies engaging lysosomal pathways”的综述文章，盘点了基于溶酶体途径的新兴蛋白降解技术，并讨论了这些技术的未来发展方向。
自噬-溶酶体途径诱导的蛋白降解
自噬是一种高度保守的细胞降解机制。其中，巨自噬是最主要的自噬降解机制，可以吞噬各类细胞内生物大分子（如蛋白质、蛋白质聚集体、DNA/RNA分子等）后传递给溶酶体降解。
自噬涉及一系列步骤，包括吞噬泡的启动、吞噬泡的成核和扩张、围绕部分细胞质的双膜自噬体的闭合和完成、与溶酶体的融合，以及自噬体中内容物的降解。LC3蛋白在此过程中扮演了非常重要的作用，目前已开出泛素相互作用基序(UIM)结合剂、共价结合剂等多种LC3的小分子配体。这些潜在的LC3配体为开发自噬依赖的蛋白降解技术提供了必需的前提条件。
除了LC3，自噬受体为进入自噬通路提供了另一种可能的对接位点。自噬受体在选择性自噬（巨自噬的一种亚型）中起着至关重要的作用。选择性自噬的货物包括许多不同类型的生物分子和细胞器，例如泛素化蛋白、过氧化物酶体和受损的线粒体。选择性自噬依赖于识别货物并将其束缚在吞噬泡上的自噬受体。例如，泛素结合蛋白SQSTM1/p62通过充当与LC3-II相互作用的衔接蛋白，靶向泛素化蛋白聚集体和细胞内细菌进行自噬降解。
自噬的步骤和底物谱（来源：Chemical Society Reviews）
ATTEC
技术全称：Autophagosome-Tethering Compound，自噬小体绑定化合物
代表性公司：PAQ Therapeutics（济景医药）、 阿泰 克
ATTEC是一种可以同时结合LC3和致病生物分子或细胞器的化合物。ATTEC可通过LC3将后者束缚在吞噬泡上，再通过自噬诱导降解。由于自噬底物的广谱性，ATTEC有望将降解剂的适用范围推广至非蛋白质生物分子或细胞器。
ATTEC及AUTOTAC示意图（来源：Signal Transduction and Targeted Therapy ）
降解蛋白。聚谷氨酰胺(polyQ)片段在不同蛋白质中的异常扩张超过一定阈值与至少九种不同的神经退行性疾病有关，统称为polyQ疾病，目前均无法治愈。其中，对亨廷顿病（HD）的研究最为广泛。目前的大量证据表明mHTT蛋白的细胞毒性是该疾病的主要原因，而野生型HTT蛋白(wtHTT)是发育过程中的必需蛋白，可能对HD起保护作用。鲁伯埙教授、丁澦教授、费义艳教授合作开发的polyQ∙ATTECs可以通过特异性识别延长的polyQ区分mHTT和wtHTT，从而以等位基因选择性的方式降低了mHTT，在小鼠模型中挽救了与HD相关的表型。与报道的靶向mHTT的PROTAC相比，等位基因选择性、靶向几种不同polyQ疾病的潜力和血脑屏障渗透性是ATTEC有吸引力的特性。此外，其他的研究课题组还开发出可以降解溴结构域蛋白4(BRD4)和烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)等肿瘤蛋白的ATTECs分子。
降解脂滴（LD）。LD是细胞存储脂质的细胞结构。由于PROTAC技术无法降解LD，以ATTECs降解LD将直接推动降解技术的进步。LDs的异常积累与肥胖、心血管疾病、脂肪肝和神经退行性疾病等许多疾病有关。鲁伯埙和丁澦团队开发的LD·ATTEC可以通过疏水相互作用识别LD，进而诱导LD的自噬降解，且不影响其他含脂质的细胞膜组织，具有良好的特异性。LD·ATTECs有效缓解了肥胖和糖尿病的小鼠遗传模型和由缺乏胆碱、L-氨基酸的高脂饮食(CDAHFD, 60 kcal%脂肪)喂养10周所诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型症状。
AUTAC
技术全称：Autophagy-Targeting Chimera，自噬靶向嵌合体
自噬靶向嵌合体(AUtophagy-TArgeting Chimera，AUTAC)是另一类利用自噬的降解技术。不同于ATTEC，AUTAC不适用LC3作为接头蛋白诱导降解，而是通过自噬受体SQSTM1/p62来劫持选择性自噬。类同于PROTAC，AUTAC也通过泛素化诱导降解。然而，PROTAC需要靶蛋白K48位点连接的多聚泛素化后的蛋白质能够被26S蛋白酶体识别并进一步降解；而AUTAC需要触发靶标的K63多聚泛素化才能实现诱导降解。核苷酸8-nitro-cGMP（8-nitrocyclic guanosine monophosphate）是细胞内调节自噬体（autophagosome）招募的重要信号分子。
AUTAC示意图（来源：Molecular Cell）
降解蛋白。研究人员开发了靶向MetAP2、FKBP12、BRD4等致病蛋白的AUTAC分子。
降解线粒体。线粒体功能障碍与许多衰老相关的疾病有关，清除功能障碍或受损的线粒体可以改善这些疾病。2019年12月发表在Molecular Cell上的一项研究中，有科学家团队开发出了一种可以促进破碎线粒体自噬的AUTAC4分子。AUTAC4利用2-苯基吲哚衍生物作为线粒体的binder，2-苯基吲哚衍生物是线粒体外膜上的转运体配体。这些结果表明，AUTAC具有广泛的应用前景，并有望在蛋白质聚集物降解等方面发挥更大的作用。
AUTOTAC
技术全称：Autophagy-Targeting Chimera，自噬靶向嵌合体
代表性公司：AUTOTAC Bio
自噬靶向嵌合体 (AUTOphagy-TArgeting Chimera，AUTOTACs) 是另一种涉及SQSTM1/p62的降解技术。但不同于需要诱导靶标泛素化降解的AUTACs，AUTOTACs直接与SQSTM1/p62 (p62zz)的ZZ结构域相互作用，不需要多泛素化。目前已开发出专门用于合成AUTOTAC的自噬靶向配体(ATL)。
降解可溶性蛋白。通过将靶蛋白配体与ATL结合，研究人员成功降解了雌激素受体β(ERβ)、雄激素受体(AR)和甲硫氨酸氨基肽酶2(MetAP2)等癌症靶标。
降解错误折叠的蛋白质聚集体。Anle138b是一种尚处于临床I期的候选化合物，可结合神经退行性蛋白病的寡聚体和聚集体。组装的AUTOTAC分子Anle138b-F105以浓度和巨自噬依赖性方式诱导外源表达的突变易聚集的desminL385P（一种参与结节病的突变蛋白）的降解。野生型结蛋白不受以上降解剂影响，表明Anle138b-F105对错误折叠聚集体的特异性。
AUTOTAC技术作用机理（来源：AUTOTACBio）
内涵体-溶酶体途径诱导的蛋白降解
内涵体主要将跨膜或细胞外底物内化后通过溶酶体降解。
LYTAC
技术全称：Lysosome-Targeting Chimaeras，溶酶体靶向嵌合体
代表性公司：Lycia Therapeutics
LYTAC也是一种双功能分子，有两个结合域一端为结合细胞表面跨膜受体CI-M6PR（cation-independentmannose-6-phosphatereceptor）的配体，另一端为靶蛋白配体。 这两个结合域通过一个化学连接基团结合。 在质膜上形成的三聚CI-M6PR–LYTAC–靶蛋白复合物会被细胞膜“吞没”，形成一个运输囊泡。 囊泡会将复合物运输到溶酶体中，之后靶蛋白被降解。
来源：Nature
细胞外蛋白。研究人员将抗小鼠IgG抗体与CI-M6PR配体poly(M6Pn)糖多肽结合生成LYTAC Ab-1，Ab-1有效介导小鼠IgG转运至溶酶体。
膜结合蛋白。通过将M6Pn糖多肽分别与靶向EGFR的抗体西妥昔单抗(ctx)和靶向PD-L1的抗体融合生成的LYTAC分子ctx-M6Pn (Ab-2)和PD-L1-M6Pn的LYTAC (Ab-3)分别诱导EGFR和PD-L1水平降低。
原则上其他内体穿梭受体也可以用于LYTAC，同时，细胞类型特异性受体可能为细胞类型受限的蛋白质降解提供合适途径。例如，ASGPR是一种内吞细胞表面受体，在内源性蛋白被内化到肝细胞并降解的自然过程中发挥关键作用。Avilar Therapeutics开发的去唾液酸糖蛋白受体靶向嵌合体（ASGPR Targeting Chimeras）一端与靶蛋白结合，一端与ASGPR结合。所产生的ASGPR-ATAC-靶蛋白复合物会被细胞膜“吞没”，形成一个运输囊泡，囊泡会将复合物运输到肝细胞溶酶体中，之后靶蛋白被降解。由于ASGPR是一种肝脏特异性溶酶体靶向受体，因此，相比LYTAC（CI-M6PR在多种细胞中广泛表达），ATAC技术能够以限制细胞类型的方式降解胞外蛋白，有潜在的安全性优势。
ASGPR Targeting Chimeras原理（来源：Avilar）
PROTAC的经验教训
对比基于溶酶体的降解剂，PROTAC的作用机制更为确定，部分原因是更多的研究团队集中于PROTAC相关研究。同时，许多关于PROTAC的机理研究提供了有价值的信息，可能有利于推动基于溶酶体的降解剂的研究。
降解途径的验证。PROTAC的降解机理主要基于抑制剂或基因敲除实验证明。目前，对基于自噬的降解剂通过自噬抑制剂或敲除关键自噬基因验证了降解途径，而对基于于内体-溶酶体的降解剂研究较少。
靶蛋白的多聚泛素化。PROTAC需要靶蛋白打上多聚泛素化的标签后诱导降解。但包括ATTECs、AUTOTACs和LYTACs等大多数基于溶酶体的降解剂尚未进行类似验证。考虑到这些基于溶酶体的降解剂预计将独立于泛素-蛋白酶体途径发挥作用，未来可以作为对照实验对多泛素化水平进行检测。
靶蛋白参与。PROTAC通常基于体外生物物理结合实验、敲除实验和/或竞争实验来验证靶蛋白。然而，在基于溶酶体降解剂中，出于缺乏资源或工具的原因，相关实验在每项研究中并不完整。
关键性三元复合物的形成。PROTAC和相关分子胶的许多三元复合物结构已在原子水平上得到解析，这种结构信息为PROTAC的作用机制和化合物优化提供了关键信息。而包括ATTECs、AUTOTACs和LYTACs在内的溶酶体途径降解剂缺乏此类关键性证据。
靶点选择策略
溶酶体能够降解多种类型的底物，包括蛋白质、蛋白质聚集体、受损细胞器等。但是以下的因素在选择溶酶体途径降解剂靶标时需要考虑，这将显著影响开发高效降解剂的成功率：
生物学/临床证据。溶酶体靶标的选择需要通过实验证明降低靶点可为患者或至少在动物模型中提供治疗益处。
亚细胞定位。基于自噬的降解剂（ATTECs、 AUTACs 和 AUTOTACs）和基于内体-溶酶体的降解剂（LYTACs 和 Mode-As）的靶点亚细胞定位是不同的。由于自噬主要发生在细胞质中，细胞质靶标更容易被基于自噬的降解剂降解；而基于内体-溶酶体的降解剂（LYTACs）只能靶向细胞外蛋白或膜蛋白。
蛋白酶体降解。基于自噬的降解剂可以诱导最初被蛋白酶体降解的蛋白质的自噬降解，针对同一靶点联用PROTACs和ATTECs / AUTACs / AUTOTACs存在竞争关系，可能反而不会提高降解效率。
内源性半衰期。通过UPS降解的蛋白质往往半衰期短，而长寿命的蛋白质（半衰期>18小时）通常是自噬底物。而大多数蛋白质半衰期较长，因此大多数蛋白质都适合通过基于自噬的降解剂进行靶向降解。
鉴定或设计靶向溶酶体途径降解剂的策略
分子胶。基于自噬的降解剂中，ATTECs和AUTOTACs基于其作用机制有可能成为分子胶降解剂。ATTECs可以作为与POI和LC3B结合的分子胶发挥作用，形成稳定的三元复合物，而AUTOTACs可以作为与POI和SQSTM1/p62结合的分子胶发挥作用。
双功能嵌合体。基于自噬溶酶体的ATTEC、AUTAC和AUTOTAC降解剂以及基于内体溶酶体的LYTAC降解剂都有成功的双功能嵌合降解剂范例。双功能嵌合降解剂具有广谱性和可扩展性。一旦确定了合适的矛头，就可以相对容易地设计这些降解剂。与分子胶相比，双功能嵌合溶酶体途径降解剂可能具有较大的分子量和不太理想的成药性，但它们可以通过理性设计来创造，不需要繁琐的筛选工作。另外，连接链的优化可能会提供更好的功效和特异性。
抗体或大分子。生物大分子或抗体作为降解剂的主要优点之一是它们的目标特异性。因此它们可以更特异地与POI结合，并且显著降低脱靶率，在开发的后期也可提供更好的安全性。但是这种策略在抗体的入膜、稳定性、运输、保存和递送方面存在挑战。
靶向溶酶体途径降解剂的潜在优势和局限性
基于溶酶体的降解技术正在兴起，并大大扩展了目标范围。然而，靶点的半衰期和亚细胞定位等其他方面特性可能会限制这些基于溶酶体降解技术的靶点谱。
无需诱导靶蛋白泛素化。基于溶酶体的降解技术作用机制不涉及PROTACs诱导的后续泛素化过程，因而开发过程可能相对简单。
自噬的高度保守性与广泛性带来的利弊。自噬在真核细胞中高度保守，并且存在于基本上所有类型的哺乳动物细胞中。因此，与依赖可能不在所有细胞类型中表达的特定E3连接酶亚基的降解技术不同，参与自噬的降解技术在所有细胞类型中都有潜在的活性。这既可能是优势，也可能是劣势。PROTAC的E3连接酶依赖性可能在长期使用后导致细胞耐药，而靶向自噬途径的降解剂没有这个限制。但是基于由于自噬的广泛性可能无法实现细胞特异性的靶蛋白降解。然而，某些自噬体也表现出一定的细胞特异性，如LC3C蛋白在大多数组织中低表达，但仅在肺和卵巢中高表达，可以基于以上特性，设计某些具有细胞类型特异性的基于自噬途径的降解剂。
溶酶体途径降解效应的数学模型非常有限。鲁伯埙教授实验团队完成了ATTECs三元复合物形成、降解动力学和稳态剂量依赖性曲线的非常初步的数学建模，但该模型仍过于简单并缺乏实验验证。对于AUTACs、AUTOTACs和LYTACs等，仍然没有相关降解数学模型的报道。
对溶酶体途径降解剂构效关系的研究不够深入。以ATTEC为例，目前的研究表明中等长度的碳链可能具有最佳功效和治疗潜力。ATTECs的药物化学优化目前仍受到缺乏LC3-ATTEC复合物结构信息的限制，在优化AUTOTAC化合物时也会面临类似的问题。
游离药物水平的确定。溶酶体途径降解剂的理化特性可能会导致脱靶效应或与血浆蛋白等发生非特异性结合。
结论
综上所述，包括ATTECs / AUTACs / AUTOTACs / LYTACs / MoDE-As在内的溶酶体途径降解剂，提供了前所未有的利用自噬或内体-溶酶体途径选择性降解致病蛋白和非蛋白质靶点的技术，从根本上扩展了降解的靶点范围。这些降解剂可能有不同的形式，包括分子胶和双功能嵌合化合物。将来还需要进一步分析以上技术的作用机理，以排除可能的其他机制。经过生物学和临床验证的，在自噬能力较强细胞里位于胞质的长半衰期靶点是基于基于自噬途径降解剂的理想靶点，而细胞外和一些跨膜靶点可以通过基于内体-溶酶体的降解剂来降解。进一步开发这些技术还需要精确的结构信息、具有更高亲和力和更具选择性的靶头、额外的SAR信息及实验数据。
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