复旦大学上海医学院
HBV持续感染引起的慢性乙型肝炎（CHB）严重危害人类健康。虽然随着乙型肝炎疫苗接种和传染病防控的推进，乙型肝炎新发病例数已大幅降低，但据统计全球仍有约2.4亿HBV慢性感染者（其中我国逾0.9亿），每年近百万人死于HBV慢性感染相关肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌等肝脏疾病。目前，临床上用于CHB治疗的药物主要有两大类，包括干扰素（IFN）和核苷（酸）类似物（NAs），但均不能有效清除病毒和治愈乙型肝炎。大量CHB患者需长期乃至终身抗病毒治疗，极大降低了患者的生活质量并造成沉重负担。
HBV感染慢性化是病毒和宿主相互作用的结果，HBV独特的复制方式对其在肝细胞内建立和维持持续性感染起到了关键作用。HBV是一种历经漫长进化、具逆转录复制特性的嗜肝DNA病毒，基因组为松弛环状部分双链DNA（relaxed circular DNA, rcDNA），大小仅约3.2 kb；HBV感染进入宿主肝细胞后，rcDNA会经由核心颗粒脱衣壳而释放入核，进而形成病毒在整个复制周期中关键的复制中间体——超螺旋的共价闭合环状DNA（cccDNA），其在琼脂糖凝胶电泳中的条带位置有别于rcDNA，位于2.0 kb标记附近；cccDNA在细胞核内与宿主组蛋白和非组蛋白等结合组装成微小染色体,经由病毒DNA复制得以补充积聚，形成cccDNA池（cccDNA pool），同时，复制产生的新病毒可在肝内进一步播散。cccDNA承担了HBV基因组储存库和病毒转录复制模板的双重角色，且相对稳定很难被根除，因此被认为是乙型肝炎慢性化和难以治愈的“元凶”。本文从现有药物对cccDNA的影响切入，分析cccDNA含量和活性的主要受控因素，探讨cccDNA池难以清除的关键特性环节，提出未来靶向cccDNA和研究的重点，以期加深对乙型肝炎慢性化和难以治愈机制的理解，为研发新型沉默清除cccDNA的策略、最终实现乙型肝炎治愈提供参考与新视角。
1 当前CHB治疗药物对cccDNA的影响
1.1 NAs治疗对cccDNA的影响
NAs是一类靶向抑制HBV逆转录酶的药物，可显著抑制HBV逆转录复制、降低病毒载量，但存在长期服药和产生耐药等缺陷。NAs从作用机制上不直接靶向核内既有cccDNA池，但理论上NAs长期治疗过程中可通过持续抑制rcDNA的形成而影响cccDNA的回补进而逐渐耗竭既有cccDNA池；此外，NAs治疗所致病毒载量下降可部分促进抗病毒免疫应答的恢复从而控制清除cccDNA。临床观察表明，NAs短期治疗对cccDNA含量的影响有限，长期治疗则可使肝内cccDNA总体水平逐渐降低，但尚不能使之完全清除，原因之一可能是NAs抑制HBV逆转录酶的效率虽然很高但仍未达100%，而即使很低水平的病毒复制亦可使cccDNA池因得到回补而不被耗竭。本课题组前期利用乙型肝炎患者肝穿刺组织进行原位cccDNA检测亦发现，阿德福韦长期治疗虽然可使血清HBV DNA被抑制到检测水平之下以及使肝内HBV抗原水平和细胞浆HBV DNA含量大幅降低，但肝细胞核内仍可检测到一定水平的cccDNA。上述研究均提示cccDNA很难通过NAs治疗而被彻底清除，并且只要机体未建立有效的抗HBV免疫应答，肝细胞核内残存的cccDNA在停药后很容易实现回补及恢复病毒复制。正因为如此，对大部分患者来说，长期使用NAs阻断cccDNA回补以保持cccDNA池处于低水平是十分有必要的，停药通常会出现不同程度的HBV DNA复制及其载量反跳和临床病情复发加重。近年有学者提出可对部分NAs长期治疗的“优势”患者（HBsAg水平低或阴性）实施停药观察，主要是寄望于患者在NAs治疗过程中或停药后短期内自身建立持续有效控制病毒复制和抗原表达的免疫机制，但临床实践表明复发率仍较高，相关风险该如何评估和管控尚有待系统研究。
1.2 IFN治疗对cccDNA的影响
IFN是一类在机体免疫防御中发挥关键作用的细胞因子，于1957年首次被发现，因具有干扰病毒感染复制的效应而得名，后来进一步被发现具有免疫调节和抗肿瘤等功能。根据所结合IFN受体的不同，其一般被分为Ⅰ（IFNα/β等）、Ⅱ（IFNγ）和Ⅲ（IFNλ）型，其中被广泛用于治疗CHB的为IFNα家族中的2a/2b亚型和相应聚乙二醇化IFNα（PEG-IFNα）。相较NAs，IFN治疗CHB具有疗程有限、HBV抗原清除率和持续应答率相对较高等优势，已使大量患者获益，还被报道能更有效地降低CHB患者肝细胞癌发生的风险。此外，近期日本一项研究报道核苷酸类药物（阿德福韦、替诺福韦）可通过诱生IFNλ而发挥核苷类药物（拉米夫定、恩替卡韦）所不具有的额外抗病毒效应，随后韩国一项研究认为这可能有利于进一步降低肝细胞癌发生的风险。虽然这两项发现还有待验证，但从另一个角度凸显了IFN在控制HBV慢性感染及所致肝脏疾病中的独特角色。
由于IFN理论上作用于任何表达Ⅰ型IFN受体的细胞（几乎各类细胞均表达），其生物学效应较复杂，已有研究表明IFN通过病毒学和免疫学两方面机制共同控制和清除HBV感染——在抗病毒方面，IFNα通过结合Ⅰ型IFN受体激活JAK-STAT信号通路，诱生具有各种抗病毒功能的干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes, ISGs），至今已陆续鉴定了十几种具有较强抗HBV功能的ISGs，包括MxA、TRIM22、MyD88、ZAP、ISG20、IFITMs和APOBEC家族蛋白等，其抗HBV的环节主要集中在抑制HBV转录后RNA稳定性、病毒蛋白翻译和装配出胞等环节。本课题组通过系统研究发现了一种IFNα抗病毒的新机制，即在HBV拮抗肝细胞内IFN诱生和应答的情况下，IFNα通过作用于肝窦内皮细胞和巨噬细胞等，将诱生的抗病毒分子经由外泌体从肝非实质细胞传递到HBV感染的肝细胞，以此抑制HBV在肝细胞中的复制。在免疫调节方面，IFN具有活化巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞和T淋巴细胞等功能，可通过调节免疫微环境中细胞因子和浸润细胞的数量及谱式等对感染有HBV的肝细胞施以免疫压力以控制清除病毒，但具体效应机制及免疫网络调控机制仍有待深入阐明。
关于IFNα对cccDNA的作用，大规模系统性临床研究不多，国内有研究表明IFNα治疗在部分患者中可致cccDNA一定程度降低，其中出现HBeAg血清转换的患者肝内cccDNA下降幅度总体大于未发生HBeAg血清转换者；相比NAs单药治疗，IFNα与NAs联用可更为有效地降低cccDNA,治疗48周后肝内cccDNA水平较低者停药复发率更低。在体内外模型研究中，Protzer团队报道高浓度IFNα作用于肝细胞可诱导脱氨酶APOBEC3A的表达，促使cccDNA发生C→U突变形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）进而被细胞碱基切除修复机制识别而降解清除，但此结果尚未被广泛验证。更多证据显示IFNα对cccDNA的作用主要表现为抑制cccDNA转录活性，而非直接降解cccDNA：Levrero团队在基于HepG2细胞的HBV转染模型中发现IFN处理通过降低cccDNA微小染色体组蛋白乙酰化修饰来抑制cccDNA的转录活性；本课题组和Bartenschlager团队先后在多种体外HBV感染模型中发现IFN在强烈抑制HBV转录和抗原表达的工作浓度下，对cccDNA含量无明显下调作用；一项利用人肝嵌合鼠的研究显示，在缺失免疫系统的情况下，IFN可有效降低HBV RNA、HBeAg和HBsAg的水平，但对cccDNA含量无显著影响，进一步支持IFN对cccDNA无直接降解作用，但不排除高浓度IFNα处理对肝细胞有毒性或IFNα在体内通过调节免疫反应等机制而间接降解cccDNA的可能性。
2 cccDNA含量和活性的主要受控因素
2.1 免疫因素
HBV母婴垂直传播和婴幼儿感染HBV慢性化比率分别为90%以上和20%~50%，而成年人感染HBV慢性化比率仅约5%，提示成熟健全的免疫应答系统在控制和清除HBV感染中扮演了重要角色。此外，即使HBV复制和抗原指标长期阴性，在免疫抑制治疗和化放疗等情况下，一定比例的患者会出现HBV再激活,进一步提示免疫因素在控制病毒复制和cccDNA活性中的关键作用。近年研究表明，HBV感染可在一定程度被宿主天然免疫系统所感知,诱生的炎性细胞因子IL-6、IL-1β和IFN与活化的NK细胞和NKT淋巴细胞等发挥控制清除HBV复制感染的作用，可抑制cccDNA的转录活性或经由 “非杀细胞”和“杀细胞”两种途径降解清除cccDNA。在天然免疫所致病毒载量大幅下降后，HBV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）所介导的免疫反应逐渐占据主导，CTL通过识别被感染肝细胞表面人类淋巴细胞抗原-Ⅰ递呈的HBV抗原肽进而导致肝细胞凋亡或坏死，cccDNA随之被清除，同时T淋巴细胞分泌的IFNγ和TNFα等细胞因子被报道可促进cccDNA“非杀细胞”式降解。大量研究表明，慢性HBV感染中天然免疫和T淋巴细胞功能受损，这可能与cccDNA池的维持有关，而抗病毒治疗有助于HBV特异性T淋巴细胞功能的恢复。体液免疫在清除胞外病毒防止再感染和协助清除病毒感染细胞方面有着重要作用，特异性抗HBs抗体的出现被认为是CHB治愈的核心标志之一，而乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG)被用来预防乃至治疗HBV感染，还有报道显示抗HBs抗体可被内吞入肝细胞而抑制HBV病毒颗粒和亚病毒颗粒分泌，但体液免疫能否直接影响cccDNA含量和活性尚不清楚。
2.2 宿主肝细胞分裂更新
与EB病毒和卡波氏肉瘤相关疱疹病毒等DNA病毒的基因组DNA可锚定于宿主染色体上不同，一般认为HBV cccDNA以游离于人类基因组染色体之外的形式存在于细胞核。因此当宿主细胞有丝分裂时，cccDNA理论上会丢失或随机分布到子代细胞。人肝嵌合小鼠模型表明肝细胞分裂可致cccDNA含量急剧下降，而随着细胞分裂速度减慢病毒学指标又会呈现反跳，支持cccDNA在肝细胞分裂时会丢失；Mason等通过检测肝细胞内HBV整合的DNA提出肝细胞克隆增殖理论，而整合有HBV DNA的肝细胞内cccDNA呈阴性则提示了cccDNA可随肝细胞分裂而丢失或由其他非杀细胞机制清除。需注意的是，正常情况下肝细胞分裂更新的周期较长，因此理论上细胞分裂所致cccDNA含量下降是个较为缓慢的过程；而从细胞分裂更新有利于cccDNA清除这个角度来说，虽然NAs可通过抑制cccDNA回补而使其含量随细胞分裂而逐渐稀释变少，但由于NAs治疗可伴有肝脏炎症的减弱和肝细胞更新的减少，这可能又减缓了cccDNA池的耗竭。
2.3 肝代谢功能状态和个体遗传背景
HBV有着强烈的嗜肝性和种属特异性，其中一大原因是cccDNA转录及HBV完成复制周期所需的宿主因子部分为人肝细胞所特异性高表达，如HNF1/4α、FXR、CREB、C/EBP及近年李文辉团队鉴定到的HBV入胞相关受体NTCP等。由于这些因子与肝脏的糖、脂肪、胆固醇和胆汁酸代谢密切相关，因此肝细胞自身的代谢和营养功能状态对cccDNA的活性和HBV复制有着显著的影响。同时，HBV感染复制可反过来影响肝细胞功能进而与HBV致病相关。本课题组近期鉴定发现维甲酸受体激动剂类小分子化合物可有效控制HBV cccDNA转录，部分机制可能与逆转HBV感染所致代谢基因的异常表达有关，加深了对cccDNA活性调控的理解，并为新型靶向策略的研发提供了新思路。鉴于肝细胞代谢功能状态对cccDNA的作用，其可能也影响着临床治疗效果和各类病毒学指标变化，仍有待研究阐明。此外，有研究提示个体遗传背景对HBV的易感性、治疗效果和cccDNA的活性及稳定性也有一定影响。
3 cccDNA难以清除的关键特性环节
3.1 cccDNA稳定性和半衰期
目前为止对cccDNA是否稳定以及其半衰期多长仍存有很大争议，不同体内外模型所测定的cccDNA半衰期不尽相同，从几十小时到几个月不等。主流的观点来自于一项土拨鼠模型的研究，其提示cccDNA在非分裂状态的肝细胞中可长期保持稳定；另一项利用小鼠模型的研究进一步表明HBV复制可能会导致其所在肝细胞分裂周期受阻滞，而不分裂的肝细胞很可能扮演了病毒基因储存库的角色。由于cccDNA池中每个cccDNA分子所处的肝细胞的细胞周期和分裂状态不同以及cccDNA自身在活性状态和DNA序列等方面的差异，可推测它们的稳定性和代谢清除速率可能不尽相同。因此，整体cccDNA池的半衰期并不能精确反映单个cccDNA分子的寿命长短，而池中某些cccDNA分子可能与HBV慢性感染及停药反跳等具有更为密切的关系。
3.2 cccDNA池含量和活性的动态调节
HBV cccDNA最初形成自rcDNA，经由病毒复制过程中新产生的rcDNA加以补充，使核内cccDNA的数量逐渐积累，但并不会无限制增加。一项体外研究认为HBV大HBs蛋白的含量对此起到了调节作用，HBV大HBs蛋白表达缺失会使得核内cccDNA数量增加6倍以上，提示HBV进化出了动态调控cccDNA池的反馈机制；另一项近期研究显示，cccDNA倾向于定位在表达活跃的人类染色体区域附近。这些特性可能使得HBV能在cccDNA含量和活性间取得较好的动态平衡，以满足病毒持续感染却又不因自身转录复制而对宿主细胞产生明显负担和毒性。一般认为cccDNA池的大小可随HBV感染自然史各阶段的发展而呈动态变化，且单个肝细胞间所含cccDNA拷贝数变异度很大（从1个拷贝/细胞到几十甚至上百个拷贝/细胞），但受限于样本获取和检测手段，尚缺乏系统性和单细胞水平的研究。
3.3 cccDNA池的基因异质性
由于HBV的聚合酶缺乏校读活性，HBV复制过程中突变概率相对较高。在HBV建立和维持持续感染的过程中，会产生各类病毒基因突变，包括低表达HBeAg的核心启动子区突变株、不表达HBeAg的前C区突变株、低表达HBsAg的前S区缺失突变株和不被中和抗体识别的S区免疫逃逸株等，这些突变使具有免疫原性的各类病毒抗原表达降低，达到HBV逃避免疫监视和清除、逐步适应宿主免疫压力进而与宿主长期共存的状态。这会造成各处肝细胞中cccDNA存在基因异质性，因此可能使cccDNA池整体具有更强的适应性而不易被个别外力所清除或耗竭。
3.4 肝细胞外cccDNA池
除肝细胞外，HBV也可能于其他细胞如外周血单个核细胞建立其基因储存库,但此类HBV DNA是否能介导病毒感染和复制尚存有争议，有待进一步研究阐明。
4 功能性治愈慢性乙型肝炎目标下cccDNA研究的重点
4.1 cccDNA生物学和模型技术的研究
由于当前治疗手段已能够较好地长期抑制HBV复制，如何减少病毒抗原表达从而进一步降低肝脏疾病风险乃至实现乙型肝炎治愈成为了临床、基础和产业界研究的共同重点。病毒学意义上，乙型肝炎治愈需彻底清除cccDNA，但cccDNA诸多特性决定了其难以被“斩尽杀绝”。近年来乙型肝炎“功能性治愈/临床治愈”的概念被提出：即肝内cccDNA长期处于非活动转录状态，血中HBV DNA阴性和HBsAg消失，此种情况下，虽然cccDNA仍少量存在，但功能学上已十分接近乙型肝炎治愈。鲁凤民团队等还提出以停药后HBV DNA和RNA持续低于检测下限以及血清HBsAg低值阳性为特征的“准临床治愈”概念。由于cccDNA活性和含量很大程度上决定了HBV DNA、RNA和HBsAg的高低有无，上述被认为较为现实可及的目标的核心都是cccDNA含量低且持续性沉默，然而，对cccDNA稳定性和活性调控以及对宿主清除沉默cccDNA机制等认识的不足阻碍了靶向性药物的研发和精准诊疗方案的制订。因此十分有必要系统加强相关基础研究，并结合临床队列加以验证。需指出的是，当前cccDNA研究的一大瓶颈是其研究手段和技术仍相对局限且较为繁复，亟待体内外cccDNA研究模型的进一步优化及cccDNA检测手段的标化和创新。
4.2 cccDNA活性标志物与优化
IFN应答相关研究当前应用NAs抗HBV治疗面临的一大重要问题是能否停药及何时停药，cccDNA的含量及活性与此密切相关。然而，cccDNA的直接检测受限于有创性的肝穿刺且检测难度较大，因此能间接反映cccDNA含量和活性的生物标志物如传统的HBsAg以及新兴的HBV RNA和HBV核心相关抗原（HBcrAg）等越来越多受到关注，但仍需在较大规模范围内对它们的临床意义作进一步研究比较，检测技术也需进一步优化和标准化。此外，关于如何区分HBsAg是来自cccDNA或整合的HBV DNA及其如何影响HBsAg的指标意义也值得深入研究。
IFN的抗病毒机制决定了其在当前乙型肝炎治疗中具有独特地位，不少患者通过IFN治疗达到了临床治愈，然而总体应答率仍不到30%（治疗48周HBeAg阴转定义为应答），且由于IFN给药方式不便和存在较多的不良反应，限制了其在临床的广泛应用。临床观察提示病毒基因型、病毒载量、基因变异以及患者ALT水平、年龄、性别和种族等病毒和宿主因素与IFN的疗效相关。但基于这些参数选择IFN适用对象后，应答率的提升幅度尚不够显著。本课题组前期研究发现血清中特定miRNAs组合和HBV剪接变异体的基线含量配合ALT有助于提高预测IFN应答的准确率，但仍需在大规模临床队列中进一步验证及优化相关预测模型。此外，也应进一步研发新的更高效的可预测IFN疗效的标志物。近期建立的以染色质免疫共沉淀-高通量二代测序技术检测乙型肝炎患者肝穿刺中cccDNA表观修饰的技术可用于cccDNA活性的研究，并有望进一步用于预测疗效。必须指出，虽然IFN发现至今已六十余年，但对IFN诱生、调控及所致有效应答的机理认识依然有限，为此应进一步加强对IFN的基础研究，包括抗病毒应答机制特别是IFN所致cccDNA沉默清除的研究，这将有助于针对性优化提高IFN的应答率和治疗价值。
4.3 新型靶向cccDNA技术的研究
近年来出现了众多新型抗HBV手段和技术，但目前尚未见可直接靶向cccDNA形成、转录和稳定性的候选药物进入临床试验。相较靶向宿主分子的抗病毒策略，靶向病毒分子理论上在抗病毒的特异性与安全性上更有优势。HBV核心蛋白和X蛋白被认为参与了cccDNA微小染色体的形成，同时与cccDNA转录调节相关，因此HBV核心蛋白和X蛋白的抑制剂被认为可能会对cccDNA的回补、转录活性和
图1HBV cccDNA代谢清除的主要途径及IFN和NAs治疗对其的影响稳定性有干预作用，这有待深入研究。此外，通过高通量筛选获得直接针对cccDNA活性和稳定性的新型小分子化合物，以及研发免疫激活/免疫正常化的手段都将为沉默清除cccDNA提供新的理论和技术支撑。
5 结语
HBV cccDNA作为乙型肝炎慢性化和难以治愈的一大根源，其沉默清除是实现乙型肝炎治愈的关键，但当前NAs和IFN两大治疗手段均无法有效清除cccDNA和治愈乙型肝炎（图1）。随着对cccDNA转录代谢以及IFN效应和调控机制等认知的加深，新的策略和技术会不断涌现。如何利用已有药物设计和优化联合/序贯治疗方案［70］以及结合新型抗病毒手段开展多靶点联合治疗以提升沉默清除cccDNA的效率将会是研究重点之一。此外，近年来高通量测序、人工智能和大数据等新兴技术平台迅猛发展，将可能为乙型肝炎的精准化诊疗提供新的研究手段和解决方案。综上，深化对cccDNA生物特性和抗病毒应答机制及影响因素的研究，不断摸索优化临床治疗方案，将有望在更多的患者中实现乙型肝炎（功能性）治愈，而鉴于其困难度和复杂性，这有赖于多学科的交叉以及基础、临床和转化医学等多方面力量的共同努力和协作。
引证本文：ZHANG JM. Research status and challenges of HBV cccDNA[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(6): 1177-1180. (in Chinese)
张继明. HBV cccDNA研究现状与挑战[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(6): 1177-1180.
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