光致发光：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出 与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。
化学发光：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激 发，在返回基态时发出光辐射。
荧光和磷光的产生
1、单重态和三重态
基态单重态(singlet state)：自旋电子成对,只有一种自旋方向↑↓, 电子自旋总和是零，光谱项的多重性是1，以S0表示 。
当基态电子激发到某高能级时, 将有两种激发态：
即受激电子自旋相反与自旋平行: ↑↓h、↑↑h。
自旋平行时多重性 为M=2x1+1=3，称为激受三重态（triplet state）用T表示， 自旋相反时多重性为1，称为激受单重态，用S表示。
激发单重态S与激发三重态T的不同点：
⑴ S态电子自旋相反，T态电子自旋平行。
⑵ tS =
⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁。
⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低 。
2．分子内的光物理过程 （Jablonski图）
辐射跃迁：
吸收：
荧光：S1最低振动能级—S0
磷光：T— S0
非辐射跃迁：
振动弛豫
内转移
外转移
系间窜跃
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态， 多为 S1→ S0跃迁， 发射波长为 λ ‘2的荧光。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；λ ‘2 > λ 2 > λ1 。
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态， T1 → S0跃迁；电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）。
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光过程很慢。光照停止后，可持续一段时间。
光谱曲线
1、激发光谱：
ex max最大激发波长 发射光谱：
em max最大发射波长
荧光（fluorescence)
磷光（phosphorescence）
荧光光谱特征：
（1）Stokes位移
（2）ex一般不影响em sp的形状
（3）吸收光谱与em sp的镜像关系
2、激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b. 发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图λ2 ,λ1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如λ‘2 )。
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。
3、镜像规则的解释
基态上振动能级分布与第一激发态上振动能级分布类似 ；基态零振动能级与第一激发态v振动能级间跃迁几率与激发态零振动能级与基态v振动能级间跃迁几率相近。
荧光的影响因素
1. 分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的刚性与共平面结构
（2）分子内及分子环境中没有诱导非辐射跃迁基团
满足以上条件的分子具有一定的荧光量子产率。
量子产率：荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之 比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小时，φF接近于1， 在通常情况下，φF总是小于1的）
荧光量子产率取决于荧光过程与非辐射跃迁过程的相对速率：
大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，ΦF=0.55 。 荧光素 ΦF=1
2．荧光与有机化合物的结构
（1）跃迁类型：π* → π 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 。
（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
（4）取代基效应： 芳环上有供电基，使荧光增强。
3．荧光与金属螯合物
(1)配体发光
(2)金属发光
4 ．温度的影响
一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下降。如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。
5．荧光熄灭（猝灭）
荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低甚至消失的现象。
1) 动态猝灭
2) 静态猝灭
3) 荧光能量转移
4) 内滤效应
1) 动态猝灭
动态猝灭（或碰撞猝灭）指激发态荧光分子与环境分子动态接触而使荧光分子由激发态通过非辐射跃迁回到基态的现象。常见猝灭剂包括O2、I-、Cs+、丙烯酰胺。
Sterm-Volmer方程：F0初始荧光；F猝灭后荧光；Q猝灭剂；Ksv猝灭常数
动态猝灭使荧光寿命降低
Kq为双分子猝灭速率常数，正比于两分子扩散系数和；
t0为无猝灭时荧光寿命。一般而言：
2) 静态猝灭
静态猝灭（或基态复合物猝灭）指基态态荧光分子与环境分子结合形成稳定的、无荧光的复合物的现象。
Ka为复合物的结合常数
静态猝灭只是改变荧光分子数目，而不改变荧光分子寿命
3) 荧光共振能量转移
所谓荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer ，FRET)是指当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时, 供体荧光分子的激发能诱发受体分子 发出荧光, 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减的现象。
能量传递的效率：
R 0 ：Foster临界距离， 为能量传递达到 50% 的距离
用途：应用能量转移测量分子内和分子间的距离（一般测量距离为 0.5~1.5R0)
4) 内滤效应
当溶液中包含吸收荧光激发光或发射光的吸光物质时，入射光由于被吸收或者发射光被吸收均会导致荧光强度降低的现象。
5）自熄灭与自吸收
当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)
荧光强度的定量关系
光吸收定律（Lambert – Beer Law）
荧光分析仪器
荧光分析仪器框图
荧光分光光度计部件
1．光源：钨灯、汞灯、氙灯、激光
激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范 围宽等特点。
其中稳定性：影响测定的重现性和精密度。
强度：影响测定的灵敏度。
2．单色器：滤光片、光栅 激发单色器和发射单色器
3．检测器
PMT Photomultiplier
CCD Charge Coupled Device
CID Charge Injected Device
问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的 有什么区别？
光源、单色器、光路、样品池
光源：
紫外-可见分光光度计的光源为氘灯与钨灯
荧光分光光度计的光源为氙灯，强度更大
单色器：
紫外-可见分光光度计的只有一个单色器
荧光分光光度计的包含激发、发射两个单色器
光路：
紫外-可见分光光度计入射光与透射光在同一直线上
荧光分光光度计激发光与发射光相互垂直
样品池：
紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光
荧光分光光度计的样品池四面透光
荧光分析方法的特点及应用
1．特点
灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；
检测下限：0.1～0.1ug/cm-3 在合适的条件下，可以达到单分子水平
2．应用
定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同。
定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。
直接荧光测定法
荧光化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的荧光产物。例如，自应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。
荧光熄灭测定法
某些物质虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会猝灭发荧光的化合物，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。
磷光分析法
1．如何获得较强的磷光
磷光发射：
电子由第一激发三重态的最低振动能级 →基态， T1 → S0跃迁。
电子由S0进入T1的可能过程（ S0 → T1禁阻跃迁）
2．磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。
· 液槽
· 斩波片
测量方法：
（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。
（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。
化学与生物发光分析法
1. 化学发光反应（Chemiluminescence）
在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时， 发射出一定波长的光。
（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；
（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当
△E=170～300 kJ/mol；位于可见光区。
（3）发光持续时间较长，反应持续进。
化学发光反应如果存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光（ bioluminescence ）
2.化学发光效率
3. 化学发光强度与化学发光分析的依据
在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多， 对于一级动力学反应：dc/dt =Kc；K 为反应速率常数。
定量依据：
（1）在一定条件下，峰值光 强度与被测物浓度成线性；
（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)， 其与被测物浓度成线性：
4. 装置与技术
发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：
静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总 发光量；试样量小，重复性差。
流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大。
5. 特点
· 灵敏度高
例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定 2x
· 仪器设备简单
不需要光源、单色器和背景校正。
· 无需发射光，无背景光、散射光等干扰
· 线性范围宽 。
缺点：可供发光用的试剂少， 应用范围较有限。
发光反应的类型与应用
1. 液相中的化学发光反应
1）应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
化学发光反应效率：0.15～0. 05
鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
鲁米诺- H2O2发光反应可检测低至
鲁米诺- H2O2发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应。利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、 Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等
通过测定生成的H2O2 ，间接测定某些生物试样，如确定氨基酸、葡萄糖含量。
2）草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光 ，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光( 冷光源)。
2. 生物发光（Bioluminescence）
生物发光是化学发光中的一类， 特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。多种 细菌、昆虫、鱼类等均能发光。可用于环境质量监测。
生物发光原理： 在生物发光分析中，通常同时涉及到酶促反应和发光反应。在pH为 7-8的介质中，在荧光虫素酶（E）和Mg(II)离子的存在下，荧光虫素 （LH2）与ATP反应，生成磷酸腺苷（AMP）荧光虫素和荧光虫素酸的 复合物及镁的焦磷酸盐（ppi）。其反应如下：
3. 电化学发光/电致发光
在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。
联系客服
