基因组复杂性与DLBCL的表观遗传调节突变和预后不良有关

Genomic complexity is associated with epigenetic regulator mutations and poor prognosis in diffuse large B-cell lymphoma

弥漫性大B细胞淋巴瘤的基因组复杂性与表观遗传调节器突变和预后不良有关

发表期刊：Oncoimmunology

发表日期：2021 Jul 20

影响因子：7.723

DOI:  10.1080/2162402X.2021.1928365

非同义体细胞突变不仅可以促进癌症的发展，还可以产生肿瘤特异性新抗原，引起宿主的抗肿瘤免疫反应。肿瘤突变负担（TMB）是一种预测性的生物标志物，用于基于免疫检查点阻断的免疫疗法，在多种类型的实体瘤中都有应用。

血液病癌症的TMB通常比实体瘤低。最常见的侵袭性B细胞淋巴瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的TMB明显高于WES测量的慢性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病。然而，流式细胞仪筛选的霍奇金Reed-Sternberg细胞的WES发现，Epstein-Barr病毒阴性的经典霍奇金淋巴瘤（cHL）的TMB中位数很高，与肺鳞状细胞癌相当。另一项研究全面分析了315个癌症相关基因外显子区域的突变，结果显示DLBCL是TMB高的癌症类型之一，每Mb有10个同义/非同义突变，18.4%的DLBCL患者表现出高TMB。

 1   数据来源

1）444名新发DLBCL成年患者被测序，424例被纳入本研究进行最终分析

2）公开的WES数据和哈佛大学研究小组保存的304例DLBCL患者

 2   分析流程

1） 靶向NGS和突变分析

2） 使用荧光多重免疫组织化学（mIHC）进行免疫分析：对13种免疫标志物进行了荧光多重免疫组化，以定量分析大型DLBCL队列中肿瘤免疫微环境和免疫检查点的组成，包括目前研究队列中的323例

3） 基因表达特征分析：为了确定两组之间有明显差异表达的基因，进行了两类非配对的微阵列意义分析（SAMs）；使用基因本体论（GO）术语对过度代表的生物途径进行分类

01 - 在没有TP53突变的情况下，高突变数和INDELs与预后不佳相关

针对275个淋巴瘤相关基因的NGS在424名患者中获得成功，包括6名经荧光原位杂交确定为MYC/BCL2-双击（DH）的高级别B细胞淋巴瘤（HGBCL）患者和418名未指明（NOS）的DLBCL患者。在这424名患者中，408名患者有1-45个非同义突变；171名患者有1-9个缺失突变（作为框架移位、次框架移位、较大的缺失或无意义突变），只有64名患者有1-2个插入突变（作为框架移位、次框架插入或无意义突变）。研究队列中非同义突变和非沉默突变（MUT）基因的平均数量分别为4.2和3.75。HGBCL-MYC/BCL2-DH与DLBCL-NOS病例相比，其平均突变数非显著性较高（5.0 vs 3.8），但MUT基因的平均数量相似。

与早期的报告一致，在这个测序队列中，活化B细胞样（ABC）DLBCL的生存率明显比生殖中心B细胞样（GCB）DLBCL差。HGBCL-MYC/BCL2-DH的生存率明显低于DLBCL-NOS，尽管是GCB原发细胞；TP53非同义突变（MUT-TP53）与GCB和ABC亚型以及HGBCL-MYC/BCL2-DH和DLBCL-NOS实体的生存率明显下降相关。在将NGS突变数与临床结果相关联时，发现只有在野生型（WT）TP53的患者中，特别是在具有WT-TP53的GCB亚型中，明显较差的生存率与非同义突变（所有分界点范围为>4至>23）和MUT基因（所有分界点范围为>4至>18）的高数量有关。图1a显示了≥6个MUT基因（MUThigh）与0-5个MUT基因（MUTlow）的生存曲线（不包括HGBCL-MYC/BCL2-DH病例）。同样，在测序基因中存在插入/缺失突变也显示出对WT-TP53的GCB-DLBCL有明显的不利影响（图1b-c）。尽管≥5个非同义突变和≥5个MUT基因与TP53突变患者的OS明显较好相关，但在多变量分析中效果不明显。

图1 DLBCL中突变数的预后分析

02 - 表观遗传调节器和TP53的突变与高突变数有关

为了了解高突变数的预后效果，作者首先比较了MUThigh患者和MUTlow患者的DLBCL-NOS的遗传特征。图2a显示了MUThigh患者中频繁（发生在≥7名患者身上）的基因突变分布，图2b（在整体DLBCL-NOS中）显示了MUThigh与MUTlow患者中更频繁突变的基因。值得注意的是，从功能上看，许多在MUThigh患者中出现的基因都参与了表观遗传调节（如KMT2D、EZH2、CREBBP、TET2、SMARCA4、DNMT3A、EP300、KDM6A和SMC3）。最富集的基因是GCB中的KMT2D（图2b-c）（在MUT高的患者中占64.9%，而在MUT低的患者中占26.7%）和ABC DLBCLs中的TP53（MUT高的患者中占46.4%，而MUT低的患者中占16.1%）。KMT2D最常见的突变类型是无义突变（48.7%），其次是错义突变（32.4%）和框移突变（20.9%）以及inframe INDEL突变（2.0%）（图2b），与TP53突变的主要错义类型相反。尽管在队列中，KMT2D和TP53在HGBCL-MYC/BCL2-DH患者中也是反复发生突变的（图2b）。

相反，在整体DLBCL-NOS和GCB/ABC两种亚型中，KMT2D非同义突变或MUT-TP53患者的非沉默突变/突变基因的平均数量明显较高（图2d，补充图2a）。从MUT低组中排除0个MUT基因的患者后，这一增加仍然是高度显著的。相反，虽然GCB与ABC亚型相比，在整体队列中与突变数增加有关，但在WT-KMT2D和MUT-KMT2D亚组中，这种关联失去了意义（补充图2a）。在六个HGBCL-MYC/BCL2-DH病例中，只有MUT-KMT2D（而不是MUT-TP53）与MUT基因数量的增加明显相关（但不是总的非同义突变数量，图2d）。

图2 突变数量多的DLBCL中富集的突变

当分别在没有MUT-TP53和存在MUT-TP53的情况下进行比较时，发现只有少数表观遗传调节因子（包括KMT2D、TET2、SMARCA4、DNMT3A和SMC1A）、MSH6（一种DNA错配修复基因）和PTPN11（一种蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员）的突变与MUThigh显著相关，与TP53突变状态无关。在MUThigh患者中，与GCB DLBCL患者相比，ABC的MYD88突变频率明显较高，而EZH2突变频率较低。

高突变数、INDELs和KMT2D突变与WT-TP53患者较低的T细胞密度有关 接下来，作者用荧光mIHC20检查了肿瘤免疫微环境，并分析了323例中遗传学和免疫特征之间的关系（补充图2b和3a）。图3a-b显示了13种免疫标志物的绝对细胞数的病例分布以及MUT高和MUT低患者之间的比较。图3c显示了MUThigh、WT-TP53和MUT-KMT2D的代表性病例中CD20+、CD3+、CD68+、CD56+、PD-1+和PD-1+细胞的单细胞强度（每个点代表一个细胞）。

补充图2 DLBCL的突变和研究队列的病例数的相关性分析

关于免疫细胞浸润，发现MUThigh与DLBCL-NOS患者总体和GCB亚型的T细胞绝对数和细胞密度较低，与WT-TP53明显相关（图3a-b，d），而瘤内巨噬细胞和自然杀伤细胞没有明显差异。对于INDELs和KMT2D非同义突变的存在也有类似的结果。只有在不排除HGBCL病例时，TP53突变与肿瘤/免疫细胞中CD8+T细胞的百分比明显下降有关。只有在具有MUT-TP53的DLBCL-NOS患者的GCB亚型中，MUThigh与T细胞密度（图3d）和肿瘤/免疫细胞中的百分比增加明显相关。

关于免疫检查点分子在肿瘤和免疫细胞中的表达，发现DLBCL-NOS和总病例中的MUThigh与CD68+巨噬细胞/CD20+B细胞中较低的PD-L1表达和CD4+/CD8+T细胞中较低的PD-1表达明显相关，通过CD68+细胞、CD20+细胞、CD3+细胞、CD3+CD4+细胞或CD3+CD8+细胞中PD-L1+/PD-1+百分比进行评估（图3d）。更确切地说，与PD-L1表达降低的关联在分子背景为ABC和WT-TP53的患者中很明显，而与PD-1表达降低的关联主要在MUT-TP53的患者中（图3e）。INDELs的存在仅在整体DLBCL-NOS中与CD68+巨噬细胞中较低的PD-L1+百分比有关（但在DLBCL亚群中没有），仅在WT-TP53的DLBCL患者中与B细胞中低的PD-L1+百分比表达有关。相反，KMT2D/TP53突变与特定细胞类型中以百分比评估的PD-1/PD-L1表达差异没有明显关系。

图3 对高突变数的DLBCL-NOS患者进行免疫学分析

03 - MUThigh显示出突出的GEP特征，包括P53相关基因

为了获得进一步的生物学洞察力，作者比较了MUThigh和MUTlow患者的基因表达谱。在整体队列、WT-TP53子集和WT-TP53 GCB子集中发现了MUThigh的突出的GEP特征（图4a）。在MUThigh WT-TP53 GCB的大量上调基因中，值得注意的特征包括IGHM、电压门控离子通道成分/调节器（CLCN1, CLCN2, KCNH4, KCNA4, CABP2）、p53抑制剂AGR2。矛盾的是，一些肿瘤抑制因子和p53途径的正向调节因子（DHRS2减弱了MDM2介导的p53降解，促凋亡的BBC3，SIK1在p53依赖的anoikis和转移抑制中的作用，CADM4和INSM2）。下调的基因包括那些在肿瘤抑制（CCDC6、RBL2、NEMF、BCLAF1、RASA1）、mRNA代谢和/或翻译调节（STAU1、SP3、DDX6、PABPC3）、细胞周期（NSA2、ANAPC16、PCNP）、表观遗传调节（SMARCA5）、降解（UBE2D2、FEM1C）等方面发挥作用的基因。在DNA修复基因中，HDAC1、ITM2A、PARP1、BCL11B、GATAD2B和RAB27A被下调，而PARP3、XRCC3、RAD54L和ERCC2在MUT高的情况下被上调。由于MUThigh基因特征显示参与了p53通路，比较了MUThigh和MUTlow患者与WT-TP53的p53/MDM2表达。只有在具有WT-TP53的ABC-DLBCL患者中，MUThigh患者与较高的WT-p53和MDM2过表达的平均水平明显相关（图4b）。相反，当分析KMT2D突变的GEP数据时，与WT-KMT2D患者相比，只有少数基因在MUT-KMT2D中显示出明显的上调，表明MUT-或WT-KMT2D病例之间存在功能异质性。

图4 大量突变基因的基因表达分析

04 - 在WES队列中的验证

作者使用公开的WES数据和哈佛大学研究小组保存的304例DLBCL患者的SNV/INDEL来验证我们的发现。这个WES队列中共发现了158个遗传驱动因素，包括85个驱动基因突变（包括本研究275个基因小组中的29个基因），65个拷贝数改变（CNA）和8个结构变异（SV）。

支持本研究NGS队列的结果，MUT-KMT2D与验证队列的基因组复杂性有关，表现为基因组SNVs（包括同义变异，仅适用于非MSI病例）、插入突变、CNAs和SVs的数量明显增加（图5a）。通过WES分析，高TMB（>75个SNVs）和INDEL数（≥5个插入/缺失突变）与WT-TP53的ABC-DLBCL生存率明显较差有关。对Chapuy等人确定的158个遗传驱动因素的分析也显示了MUT-KMT2D和MUThigh与基因组复杂性的不良预后影响之间的相关性。MUT-KMT2D与MUT驱动基因、驱动CNAs和驱动SVs的数量增加显著相关（补充图6a）。在ABC-DLBCL和用R-CHOP治疗的C5基因亚群中，有≥6个MUT驱动基因的患者的生存率明显比没有MUT驱动基因的患者差（补充图6b）。此外，在ABC-DLBCL中，≥5个驱动基因的CNAs和≥3个SVs与明显较差的生存率有关（补充图6c）。

补充图6 验证队列中遗传驱动因素的预后和相关分析

在134名有肿瘤/正常配对样本可用于基因改变分析的患者中，KMT2D非同义突变仍与基因组SNVs和插入突变的数量增加显著相关（图5a）。当MUT-KMT2D病例与验证组中EZH2、KMT2A、ARID1A、ARID1B、SMARCA4、KDM6A或CHD2非同义突变的病例结合在一起时，这种关联的意义得到加强，这些基因突变在MUThigh与MUTlow病例中比例过高。这些突变与衰老和非典范AID特征相关；相反，KMT2D非同义突变只与衰老突变特征相关。此外，在这134名患者的WT-TP53 ABC-DLBCL子集中，高数量的SNVs、MUT基因和INDELs以及KMT2D突变都与明显较差的生存率有关（图5b-e）。

图5 哈佛研究小组的验证队列中的基因组复杂性的相关性和预后性分析

综上所述，KMT2D非同义突变与DLBCL基因组不稳定性有关，基因组复杂性与预后不良以及TP53野生型的DLBCL中巨噬细胞和B细胞中T细胞和PD-L1表达减少有关。需要进一步研究阐明DLBCL突变在DLBCL患者中的致癌和新抗原作用，以及遗传和免疫生物标志物的治疗意义。

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