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基因组复杂性与DLBCL的表观遗传调节突变和预后不良有关
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2022.08.13 内蒙古

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Genomic complexity is associated with epigenetic regulator mutations and poor prognosis in diffuse large B-cell lymphoma

弥漫性大B细胞淋巴瘤的基因组复杂性与表观遗传调节器突变和预后不良有关

发表期刊:Oncoimmunology

发表日期:2021 Jul 20

影响因子:7.723

DOI:  10.1080/2162402X.2021.1928365

非同义体细胞突变不仅可以促进癌症的发展,还可以产生肿瘤特异性新抗原,引起宿主的抗肿瘤免疫反应。肿瘤突变负担(TMB)是一种预测性的生物标志物,用于基于免疫检查点阻断的免疫疗法,在多种类型的实体瘤中都有应用。

血液病癌症的TMB通常比实体瘤低。最常见的侵袭性B细胞淋巴瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的TMB明显高于WES测量的慢性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病。然而,流式细胞仪筛选的霍奇金Reed-Sternberg细胞的WES发现,Epstein-Barr病毒阴性的经典霍奇金淋巴瘤(cHL)的TMB中位数很高,与肺鳞状细胞癌相当。另一项研究全面分析了315个癌症相关基因外显子区域的突变,结果显示DLBCLTMB高的癌症类型之一,每Mb10个同义/非同义突变,18.4%DLBCL患者表现出高TMB

 1   数据来源

1)444名新发DLBCL成年患者被测序,424例被纳入本研究进行最终分析

2)公开的WES数据和哈佛大学研究小组保存的304DLBCL患者

 2   分析流程

1) 靶向NGS和突变分析

2) 使用荧光多重免疫组织化学(mIHC)进行免疫分析:对13种免疫标志物进行了荧光多重免疫组化,以定量分析大型DLBCL队列中肿瘤免疫微环境和免疫检查点的组成,包括目前研究队列中的323

3) 基因表达特征分析:为了确定两组之间有明显差异表达的基因,进行了两类非配对的微阵列意义分析(SAMs);使用基因本体论(GO)术语对过度代表的生物途径进行分类

01 - 在没有TP53突变的情况下,高突变数和INDELs与预后不佳相关

针对275个淋巴瘤相关基因的NGS424名患者中获得成功,包括6名经荧光原位杂交确定为MYC/BCL2-双击(DH)的高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)患者和418名未指明(NOS)的DLBCL患者。在这424名患者中,408名患者有1-45个非同义突变;171名患者有1-9个缺失突变(作为框架移位、次框架移位、较大的缺失或无意义突变),只有64名患者有1-2个插入突变(作为框架移位、次框架插入或无意义突变)。研究队列中非同义突变和非沉默突变(MUT)基因的平均数量分别为4.23.75HGBCL-MYC/BCL2-DHDLBCL-NOS病例相比,其平均突变数非显著性较高(5.0 vs 3.8),但MUT基因的平均数量相似。

与早期的报告一致,在这个测序队列中,活化B细胞样(ABCDLBCL的生存率明显比生殖中心B细胞样(GCBDLBCL差。HGBCL-MYC/BCL2-DH的生存率明显低于DLBCL-NOS,尽管是GCB原发细胞;TP53非同义突变(MUT-TP53)与GCBABC亚型以及HGBCL-MYC/BCL2-DHDLBCL-NOS实体的生存率明显下降相关。在将NGS突变数与临床结果相关联时,发现只有在野生型(WTTP53的患者中,特别是在具有WT-TP53GCB亚型中,明显较差的生存率与非同义突变(所有分界点范围为>4>23)和MUT基因(所有分界点范围为>4>18)的高数量有关。图1a显示了≥6MUT基因(MUThigh)与0-5MUT基因(MUTlow)的生存曲线(不包括HGBCL-MYC/BCL2-DH病例)。同样,在测序基因中存在插入/缺失突变也显示出对WT-TP53GCB-DLBCL有明显的不利影响(图1b-c)。尽管≥5个非同义突变和≥5MUT基因与TP53突变患者的OS明显较好相关,但在多变量分析中效果不明显。

图1 DLBCL中突变数的预后分析

02 - 表观遗传调节器和TP53的突变与高突变数有关

为了了解高突变数的预后效果,作者首先比较了MUThigh患者和MUTlow患者的DLBCL-NOS的遗传特征。图2a显示了MUThigh患者中频繁(发生在≥7名患者身上)的基因突变分布,图2b(在整体DLBCL-NOS中)显示了MUThighMUTlow患者中更频繁突变的基因。值得注意的是,从功能上看,许多在MUThigh患者中出现的基因都参与了表观遗传调节(如KMT2DEZH2CREBBPTET2SMARCA4DNMT3AEP300KDM6ASMC3)。最富集的基因是GCB中的KMT2D(图2b-c)(在MUT高的患者中占64.9%,而在MUT低的患者中占26.7%)和ABC DLBCLs中的TP53MUT高的患者中占46.4%,而MUT低的患者中占16.1%)。KMT2D最常见的突变类型是无义突变(48.7%),其次是错义突变(32.4%)和框移突变(20.9%)以及inframe INDEL突变(2.0%)(图2b),与TP53突变的主要错义类型相反。尽管在队列中,KMT2DTP53HGBCL-MYC/BCL2-DH患者中也是反复发生突变的(图2b)。

相反,在整体DLBCL-NOSGCB/ABC两种亚型中,KMT2D非同义突变或MUT-TP53患者的非沉默突变/突变基因的平均数量明显较高(图2d,补充图2a)。从MUT低组中排除0MUT基因的患者后,这一增加仍然是高度显著的。相反,虽然GCBABC亚型相比,在整体队列中与突变数增加有关,但在WT-KMT2DMUT-KMT2D亚组中,这种关联失去了意义(补充图2a)。在六个HGBCL-MYC/BCL2-DH病例中,只有MUT-KMT2D(而不是MUT-TP53)与MUT基因数量的增加明显相关(但不是总的非同义突变数量,图2d)。

图2 突变数量多的DLBCL中富集的突变

当分别在没有MUT-TP53和存在MUT-TP53的情况下进行比较时,发现只有少数表观遗传调节因子(包括KMT2DTET2SMARCA4DNMT3ASMC1A)、MSH6(一种DNA错配修复基因)和PTPN11(一种蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员)的突变与MUThigh显著相关,与TP53突变状态无关。在MUThigh患者中,与GCB DLBCL患者相比,ABCMYD88突变频率明显较高,而EZH2突变频率较低。

高突变数、INDELsKMT2D突变与WT-TP53患者较低的T细胞密度有关 接下来,作者用荧光mIHC20检查了肿瘤免疫微环境,并分析了323例中遗传学和免疫特征之间的关系(补充图2b3a)。图3a-b显示了13种免疫标志物的绝对细胞数的病例分布以及MUT高和MUT低患者之间的比较。图3c显示了MUThighWT-TP53MUT-KMT2D的代表性病例中CD20+CD3+CD68+CD56+PD-1+PD-1+细胞的单细胞强度(每个点代表一个细胞)。

补充图2 DLBCL的突变和研究队列的病例数的相关性分析

关于免疫细胞浸润,发现MUThighDLBCL-NOS患者总体和GCB亚型的T细胞绝对数和细胞密度较低,与WT-TP53明显相关(图3a-bd),而瘤内巨噬细胞和自然杀伤细胞没有明显差异。对于INDELsKMT2D非同义突变的存在也有类似的结果。只有在不排除HGBCL病例时,TP53突变与肿瘤/免疫细胞中CD8+T细胞的百分比明显下降有关。只有在具有MUT-TP53DLBCL-NOS患者的GCB亚型中,MUThighT细胞密度(图3d)和肿瘤/免疫细胞中的百分比增加明显相关。

关于免疫检查点分子在肿瘤和免疫细胞中的表达,发现DLBCL-NOS和总病例中的MUThighCD68+巨噬细胞/CD20+B细胞中较低的PD-L1表达和CD4+/CD8+T细胞中较低的PD-1表达明显相关,通过CD68+细胞、CD20+细胞、CD3+细胞、CD3+CD4+细胞或CD3+CD8+细胞中PD-L1+/PD-1+百分比进行评估(图3d)。更确切地说,与PD-L1表达降低的关联在分子背景为ABCWT-TP53的患者中很明显,而与PD-1表达降低的关联主要在MUT-TP53的患者中(图3e)。INDELs的存在仅在整体DLBCL-NOS中与CD68+巨噬细胞中较低的PD-L1+百分比有关(但在DLBCL亚群中没有),仅在WT-TP53DLBCL患者中与B细胞中低的PD-L1+百分比表达有关。相反,KMT2D/TP53突变与特定细胞类型中以百分比评估的PD-1/PD-L1表达差异没有明显关系。

图3 对高突变数的DLBCL-NOS患者进行免疫学分析

03 - MUThigh显示出突出的GEP特征,包括P53相关基因

为了获得进一步的生物学洞察力,作者比较了MUThighMUTlow患者的基因表达谱。在整体队列、WT-TP53子集和WT-TP53 GCB子集中发现了MUThigh的突出的GEP特征(图4a)。在MUThigh WT-TP53 GCB的大量上调基因中,值得注意的特征包括IGHM、电压门控离子通道成分/调节器(CLCN1, CLCN2, KCNH4, KCNA4, CABP2)、p53抑制剂AGR2。矛盾的是,一些肿瘤抑制因子和p53途径的正向调节因子(DHRS2减弱了MDM2介导的p53降解,促凋亡的BBC3SIK1p53依赖的anoikis和转移抑制中的作用,CADM4INSM2)。下调的基因包括那些在肿瘤抑制(CCDC6RBL2NEMFBCLAF1RASA1)、mRNA代谢和/或翻译调节(STAU1SP3DDX6PABPC3)、细胞周期(NSA2ANAPC16PCNP)、表观遗传调节(SMARCA5)、降解(UBE2D2FEM1C)等方面发挥作用的基因。在DNA修复基因中,HDAC1ITM2APARP1BCL11BGATAD2BRAB27A被下调,而PARP3XRCC3RAD54LERCC2MUT高的情况下被上调。由于MUThigh基因特征显示参与了p53通路,比较了MUThighMUTlow患者与WT-TP53p53/MDM2表达。只有在具有WT-TP53ABC-DLBCL患者中,MUThigh患者与较高的WT-p53MDM2过表达的平均水平明显相关(图4b)。相反,当分析KMT2D突变的GEP数据时,与WT-KMT2D患者相比,只有少数基因在MUT-KMT2D中显示出明显的上调,表明MUT-WT-KMT2D病例之间存在功能异质性。

图4 大量突变基因的基因表达分析

04 - 在WES队列中的验证

作者使用公开的WES数据和哈佛大学研究小组保存的304DLBCL患者的SNV/INDEL来验证我们的发现。这个WES队列中共发现了158个遗传驱动因素,包括85个驱动基因突变(包括本研究275个基因小组中的29个基因),65个拷贝数改变(CNA)和8个结构变异(SV)。

支持本研究NGS队列的结果,MUT-KMT2D与验证队列的基因组复杂性有关,表现为基因组SNVs(包括同义变异,仅适用于非MSI病例)、插入突变、CNAsSVs的数量明显增加(图5a)。通过WES分析,高TMB>75SNVs)和INDEL数(≥5个插入/缺失突变)与WT-TP53ABC-DLBCL生存率明显较差有关。对Chapuy等人确定的158个遗传驱动因素的分析也显示了MUT-KMT2DMUThigh与基因组复杂性的不良预后影响之间的相关性。MUT-KMT2DMUT驱动基因、驱动CNAs和驱动SVs的数量增加显著相关(补充图6a)。在ABC-DLBCL和用R-CHOP治疗的C5基因亚群中,有≥6MUT驱动基因的患者的生存率明显比没有MUT驱动基因的患者差(补充图6b)。此外,在ABC-DLBCL中,≥5个驱动基因的CNAs≥3SVs与明显较差的生存率有关(补充图6c)。

补充图6 验证队列中遗传驱动因素的预后和相关分析

134名有肿瘤/正常配对样本可用于基因改变分析的患者中,KMT2D非同义突变仍与基因组SNVs和插入突变的数量增加显著相关(图5a)。当MUT-KMT2D病例与验证组中EZH2KMT2AARID1AARID1BSMARCA4KDM6ACHD2非同义突变的病例结合在一起时,这种关联的意义得到加强,这些基因突变在MUThighMUTlow病例中比例过高。这些突变与衰老和非典范AID特征相关;相反,KMT2D非同义突变只与衰老突变特征相关。此外,在这134名患者的WT-TP53 ABC-DLBCL子集中,高数量的SNVsMUT基因和INDELs以及KMT2D突变都与明显较差的生存率有关(图5b-e)。

图5 哈佛研究小组的验证队列中的基因组复杂性的相关性和预后性分析

综上所述,KMT2D非同义突变与DLBCL基因组不稳定性有关,基因组复杂性与预后不良以及TP53野生型的DLBCL中巨噬细胞和B细胞中T细胞和PD-L1表达减少有关。需要进一步研究阐明DLBCL突变在DLBCL患者中的致癌和新抗原作用,以及遗传和免疫生物标志物的治疗意义。

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