杂志：Science
影响因子：41.037
发表日期：2014年5月
有限的证据表明，人类对上皮癌具有突变特异性的T细胞应答。我们使用了全基因组测序的方法来证明来自转移性胆管癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）包含CD4 + T辅助细胞1（TH1）细胞，该细胞识别癌症表达的erbb2相互作用蛋白（ERBB2IP）的突变。在过继转移含有约25％突变特异性TH1细胞的TIL之后，患者实现了目标病变的减少和疾病的长期稳定。疾病进展后，患者接受突变反应性TH1细胞> 95％的纯种群的过继治疗，再次经历了肿瘤消退。这些结果提供了证据，表明可以利用针对突变抗原的CD4 + T细胞应答来介导转移性上皮癌的消退。
Fig. 1. Patient 3737–TIL harbor ERBB2IP mutation–specific CD4+ T cells.
3737患者的TIL有靶向ERBB2IP的突变特异性CD4 + T细胞。
3737号患者为43岁的患有广泛转移性胆管癌的妇女，切除肺癌转移灶，用于T细胞的生成，全基因组测序显示26个非同义突变，为了测试患者的TIL是否识别出这些突变中的任何突变，我们对于每个突变，设计了一个小基因构建体TMG（多个小基因串联以产生串联小基因构建体）
1A）将3737患者的TIL分别与未转染的DC（MOCK），绿色荧光蛋白GFP RNA转染的DC或指定的TMG构建体转染的DC共培养， 20小时后进行IFN-γ酶联免疫吸附测定。“>”表示每1e3个细胞大于500个斑点。
1B）将3737患者的TIL分别与未转染的DC（MOCK），绿色荧光蛋白GFP RNA转染的DC或指定的TMG构建体转染的DC共培养，24小时后进行流式细胞仪分析。
1C）为了确定3737-TIL可以识别TMG-1的9种突变中的哪一种，我们合成了9种其他TMG-1的构建体，每个构建体都包含一种突变返回到野生型序列的还原。
1D）CD4 + Vb22 +T细胞与野生型ERBB2IP肽、 ERBB2IP突变肽、突变的ALK肽分别与自体B细胞脉冲共培养6小时。
1E）将Vb22 +TCR转导至自体外周血T细胞形成TCRT，内源性Vb22 + TCR恒定区与小鼠恒定区交换，从而允许使用针对小鼠TCRβ恒定区的抗体（mTCRβ）检测引入的TCR。将TCRT及未改造过的外周血T细胞与经以上四种肽转染的自体B细胞共培养，再进行流式分析。
图一结论：
1、3737患者TIL主要靶向ERBB2IP突变，大多数ERBB2IP突变反应性T细胞由Vb22 + T细胞克隆组成。
2、经TCR改造的外周血T细胞对突变的ERBB2IP肽具有特异性反应性。
Fig. 2. Adoptive transfer of TIL containing ERBB2IP mutation–reactive T cells.
图2.包含ERBB2IP突变反应性T细胞的TIL的过继转移。
2A）3737患者接受了4.24x10^8 TIL的回输。用流式技术分析回输产品中CD4 +或CD8 + T细胞所占比例。
2B）测试回输产品。将3737-TIL与经TMG-1 野生型ERBB2IP或TMG-1编码转染的DC共培养 ，24小时后用流式细胞术分析CD4 + T细胞上OX40和Vb 22的表达。
2C）用IFN-γ酶联免疫吸附法在3737 -TIL的细胞过继转移之前和之后对患者3737血清样品的检测。
2D）3737-TIL输注前后的肿瘤生长曲线。
图二结论：1、回输治疗产品中约25％为Vb22 +CD4+T细胞。
2、细胞输注后的前5天，血清中检测到IFN-γ水平明显升高。
3、输注治疗后2个月的随访中观察到肿瘤消退，7个月后肺部病灶进展，但未在肝脏中观察到疾病进展。
Fig. 3 | Treatment with anti-CD24 mAb promotes phagocytic clearance of human cancer cells.
CD24 抗体可促进人类癌细胞的吞噬清除。
3a）代表性的流式细胞术图，描绘了与IgG对照相比，用CD24抗体，CD47抗体或双重处理处理的MCF-7细胞的吞噬作用。FITC，异硫氰酸荧光素。与IgG对照相比，加CD24 抗体后吞噬作用的强烈增加，这大于CD47阻断所观察到的效果，同时联合CD24抗体及CD47抗体后可见巨噬细胞的吞噬明显增强。
3b）MCF-7，APL1和Panc1细胞系和U-87 GM细胞系的吞噬作用条形图。【 MCF-7 人乳腺癌细胞、 APL1胰腺神经内分泌肿瘤、 Panc1 人胰腺癌细胞系、 U-87 GM 脑星形胶质母细胞瘤】3b）MCF-7，APL1和Panc1细胞系和U-87 GM细胞系的吞噬作用条形图。【 MCF-7 人乳腺癌细胞、 APL1胰腺神经内分泌肿瘤、 Panc1 人胰腺癌细胞系、 U-87 GM 脑星形胶质母细胞瘤】
3c）与Cas9对照巨噬细胞相比，Siglec-10敲除的巨噬细胞对CD24抗体治疗的反应明显降低。CD24的表达与对CD24阻断的反应呈线性正相关。
3e）测量原发性卵巢癌吞噬功能的工作流程。
3f）与IgG对照相比，用抗CD24 mAb，抗CD47 mAb或双重治疗处理的原代卵巢癌细胞的吞噬作用。转移性卵巢癌患者腹水中收集卵巢癌细胞，在体外用CD24抗体或CD47抗体治疗治疗，而后与巨噬细胞共培养，从而测量其吞噬作用。CD24抗体及CD47抗体应用后，产生的效果明显大于CD47阻断，CD24和CD47阻断抗体的双重治疗至少可以增加吞噬作用。
Fig. 3. Functional phenotype and persistence of E RBB2IP mutation –specific CD4+ T cells.
图3.ERBB2IP突变特异性CD4 + T细胞的功能表型和持久性。
3A）将患者3737–TIL与自体B细胞共培养6小时，并用wt ERBB2IP肽，mut ALK或mut ERBB2IP肽脉冲过夜。流式细胞仪用于评估Vb22的表达，并检测CD4 +群体中IL-2，TNF和IFN-γ的细胞内产生。
3B）显示了对TCR β链可变区进行深度测序的结果以测量转移治疗细胞（3737-TIL）中2种T细胞克隆的频率。（不同时间的外周血样本、3个治疗后进展的肺部病灶、1个治疗之前切除的肺部病灶）
图三结论：1、突变的ERBB2IP肽刺激Vb22 + CD4 + T细胞可诱导IFN-γ，TNF和IL-2的稳定共表达。
2、 ACT前，外周血中Vb22 + CD4 + T细胞数量较少，治疗后明显增加，且在治疗后18个月检测时发现肺部肿瘤中仍有Vb22 + CD4 + T细胞的浸润。
图4.用高纯度的Vb22 + ERBB2IP突变反应性CD4 + T细胞治疗后肿瘤消退的证据。
4A）用于再处理的TIL产品的流式细胞仪分析。
4B）将再处理的TIL与自体B细胞共培养6小时，用wt或mut ERBB2IP 肽脉冲过夜。流式细胞仪用于检测CD4 +群体中细胞内TNF的产生。
4C）第二次回输治疗后的肿瘤变化情况。
图四结论：> 95％的Vb22 + TH1细胞回输治疗后，患者经历了靶病变的减少，但是与第一次治疗不同的是，即使在第一个月的随访中也观察到了肿瘤消退，并且在最后的六个月随访时仍观察到了消退。
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